El uso de ARN de secuenciación para detectar novela de empalme variantes relacionadas con la resistencia de drogas en<em> In Vitro</em> modelos de cáncer

Summary

Aquí se describe un protocolo destinado a investigar el impacto de corte y empalme aberrante de resistencia a fármacos en tumores sólidos y neoplasias hematológicas. Para este objetivo, se analizaron los perfiles de transcriptómica de modelos parentales y resistentes in vitro a través de RNA-seq y establecimos un método basado QRT-PCR para validar los genes candidatos.

Abstract

La resistencia a fármacos sigue siendo un problema importante en el tratamiento del cáncer tanto para neoplasias hematológicas y tumores sólidos. La resistencia intrínseca o adquirida puede ser causada por una variedad de mecanismos, incluyendo el aumento de la eliminación del fármaco, disminución de la captación del fármaco, la inactivación de drogas y alteraciones de objetivos farmacológicos. Los datos recientes muestran que, aparte de por el conocido genética (mutación, amplificación) y epigenética (hipermetilación del ADN, modificación posterior a la traducción de histonas) modificaciones, los mecanismos de resistencia a fármacos también podría ser regulados por las aberraciones de empalme. Este es un campo de rápido crecimiento de la investigación que merece atención en el futuro con el fin de planificar estrategias terapéuticas más eficaces. El protocolo descrito en el presente documento está dirigido a investigar el impacto de corte y empalme aberrante en la resistencia a fármacos en tumores sólidos y neoplasias hematológicas. Para este objetivo, se analizaron los perfiles de transcriptómica de varios modelos in vitro a través de RNA-seq y establecered un QRT-PCR basado en el método para validar los genes candidatos. En particular, se evaluó el corte y empalme diferencial de ddx5 y PKM transcripciones. El corte y empalme aberrante detectado por la herramienta computacional MATS fue validado en células leucémicas, lo que demuestra que las diferentes variantes de corte y empalme ddx5 se expresan en las células resistentes frente a los padres. En estas células, también se observó una relación más alta PKM2 / PKM1, que no se detectó en la contraparte gemcitabina resistente Panc-1 en comparación con células parentales Panc-1, lo que sugiere un mecanismo diferente de resistencia a las drogas inducida por la exposición gemcitabina.

Introduction

A pesar de considerables avances en el tratamiento del cáncer, la resistencia de las células malignas a la quimioterapia, ya sea intrínseca o adquirida a la exposición prolongada de drogas, es la razón principal para el fracaso del tratamiento en una amplia gama de leucemia y tumores sólidos ^1.

Con el fin de delinear los mecanismos que subyacen a la resistencia a fármacos, en los modelos de línea celular in vitro se desarrollan por etapas de selección de las células cancerosas resistentes a los agentes quimioterapéuticos. Este procedimiento imita los regímenes utilizados en los entornos clínicos y por lo tanto permite la investigación en profundidad de los mecanismos de resistencia pertinentes. Las células resistentes que sobreviven al tratamiento son entonces distinguirse de las células sensibles de los padres mediante el uso de ensayos de viabilidad celular / ² de citotoxicidad. En los perfiles de resistencia a fármacos in vitro de células primarias han demostrado ser significativamente relacionada con la respuesta clínica a la quimioterapia ^3.

cytoto de alto rendimientoensayos xicidad constituyen un método conveniente para determinar la sensibilidad a fármacos in vitro. En este documento, la viabilidad de las células se evalúa mediante por ejemplo la 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil bromuro de tetrazolio – ensayo de MTT ^4, que se basa en la conversión metabólica de ciertos sustratos (es decir, sales de tetrazolio) en productos de color, lo que refleja así la actividad mitocondrial de las células. Alternativamente, el contenido de proteína celular puede cuantificarse utilizando la sulforodamina B (SRB) de ensayo ^5. Aquí, el número de células viables es proporcional a la densidad óptica (DO) medida a una longitud de onda apropiada en un espectrofotómetro, sin necesidad de extensa y consume mucho tiempo procedimientos de recuento de células. La inhibición del crecimiento inducida por un determinado fármaco quimioterapéutico se puede calcular sobre la base de la DO de los pocillos en los que las células fueron tratadas con un agente de ensayo y se compara con el diámetro exterior de las células de control no tratadas. Una curva de dosis-respuesta es obtained por el trazado de las concentraciones de fármaco frente a porcentajes de células viables con respecto a las células control. Finalmente, la sensibilidad al fármaco puede ser reportada como la concentración que da como resultado 50% de inhibición del crecimiento celular en comparación con las células no tratadas (IC _50).

Los mecanismos que subyacen a la resistencia a fármacos incluyen muchas anomalías diferentes, tales como las alteraciones que afectan a la expresión de genes de los determinantes de la actividad del fármaco y el metabolismo celular. Estas lesiones moleculares, incluyendo mutaciones, aberraciones en un transcripcional y post-transcripcional, así como la regulación epigenética perturbado a menudo afectan a los genes implicados en el metabolismo de fármacos, ya sea o apoptosis ^6.

Splicing alternativo de pre-mRNA y su intrincada regulación han recibido recientemente una atención considerable como una entidad nueva que pueda dictar la resistencia a fármacos de las células cancerosas ^7. Hasta 95% de los genes humanos están empalmados alternativamente en las células normales por medio de estafirmemente proceso regulado que produce muchos diferentes isoformas de la proteína a partir del mismo gen. Splicing alternativo es a menudo desregulado en el cáncer y varios tumores se caracterizan por empalme alterada de un número creciente de genes implicados en el metabolismo de fármacos (es decir, la desoxicitidina quinasa, folilpoliglutamato sintetasa, o las proteínas de resistencia a múltiples fármacos) ^6,8. Sin embargo, el análisis exhaustivo de los perfiles de empalme de las células resistentes a los fármacos está dolorosamente ausente. Por lo tanto, es imperativo desarrollar métodos de alto rendimiento para el análisis de corte y empalme alternativo. Esto podría ayudar a desarrollar enfoques terapéuticos más eficaces.

Durante la última década, el rápido desarrollo de las tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS) ha enriquecido la investigación biomédica con nuevos conocimientos sobre los mecanismos moleculares que regulan la regulación de la expresión del genoma y su papel en diversos procesos biológicos ^9. RNA-secuenciación (RNA-seq) es un potente sub-aplicaciónde NGS en el campo de la transcriptómica. Permite un perfilado en todo el genoma (cualitativa y cuantitativamente) de los patrones de expresión de miles de genes simultáneamente y es muy adecuado para la caracterización de nuevos mRNAs de codificación así como de larga ARN no codificante, miRNA, siRNA, y otra RNA pequeña clases (por ejemplo, snRNA y Pirna) ^10,11.

RNA-Seq tiene muchas ventajas sobre las tecnologías anteriores para la caracterización transcriptoma (por ejemplo, secuenciación Sanger y microarrays de expresión). No se basa en la anotación del genoma existente, que tiene un nivel de un solo nucleótido de la resolución y tiene un rango dinámico más amplio para la estimación del nivel de expresión. En pocas palabras, el flujo de trabajo experimental básico de experimentos de RNA-seq consiste en la selección transcripción poliadenilado (ARNm) y la fragmentación, seguido de la conversión en cDNA, construcción de la biblioteca y la secuenciación profunda finalmente, masivamente paralelo ^12,13. Debido a la rápida caída de sequencincostos ga lo largo de los últimos años, el RNA-seq está reemplazando gradualmente a otras tecnologías y se están haciendo esfuerzos significativos para mejorar los protocolos de preparación de la biblioteca. Por ejemplo, ahora es posible retener la información hebra de transcritos de ARNm mediante el marcado de la segunda cadena de ADNc con trifosfato de desoxiuridina (dUTP) y, antes de la PCR de amplificación, la digestión de la hebra marcada con uracil-DNA-glicosilasa (UDG). Este proceso mejora la exactitud de la anotación de genes y la estimación de los niveles de expresión ^14,15.

El análisis e interpretación de datos de RNA-seq requieren paquetes de software de cálculo complejas y de gran alcance y su transformación en tuberías bioinformáticas ^16,17. En primer lugar, la prima lee someten a control de calidad mediante la eliminación de artefactos técnicos y biológicos y descartar (recorte) las secuencias que no llegan a estrictos requisitos de calidad. Posteriormente las lecturas para cada muestra se asignan a un genoma de referencia e indexadoen-nivel de genes, a nivel de exón, o a nivel de transcripción, con el fin de determinar la abundancia de cada categoría. Dependiendo de la aplicación, los datos refinados se calculan entonces a través de modelos estadísticos para la identificación de la expresión específica de alelo, splicing alternativo, fusiones de genes y polimorfismos de nucleótido único (SNP) ^12. Finalmente, el análisis diferencial en el nivel seleccionado (es decir, la expresión de genes o corte y empalme alternativo) se puede utilizar para comparar las muestras obtenidas en diferentes condiciones.

El análisis diferencial de empalme se describen las diferencias en el uso del sitio de empalme entre dos muestras. Un número creciente de paquetes de software dedicados a este propósito están disponibles basadas en diferentes modelos estadísticos, actuaciones y la interfaz de usuario ^18. Entre estos, MATS (análisis multivariante de la transcripción de empalme) emerge como una herramienta computacional de libre disposición y precisa sobre la base de un marco estadístico Bayesiano y diseñados para detectar diferential eventos de empalme de forma de datos de ARN-ss finales individuales o pareadas. A partir de los archivos alineados (.bam), MATS puede detectar todos los tipos de eventos alternativos de empalme (salto de exón, alternativa 'del sitio de empalme alternativo, 5' del sitio de empalme 3, mutuamente excluyentes exones e intrones de retención – véase también la Figura 1).

En primer lugar, se identifica el software lee la cual soporta un determinado evento de empalme, por ejemplo la omisión de exón, y los clasifica en dos tipos. "La inclusión lee" (para el evento de empalme canónica) mapear dentro del exón investigado y abarcan las uniones entre las que el exón específico y los dos exones que flanquean aguas arriba y aguas abajo. "Skipping lee" (para el evento de corte y empalme alternativo) abarcan la unión entre los dos exones que flanquean. Posteriormente, MATS devuelve el nivel de inclusión normalizada, tanto para los eventos canónicas y alternativa y compara los valores entre las muestras o condiciones. En última instancia, se calcula un valor de pnd tasa de falso descubrimiento (FDR), suponiendo que la diferencia en la relación variante de un gen entre dos condiciones excede un umbral definido por el usuario determinado para cada caso de empalme ^19,34.

Tras el análisis diferencial de empalme en conjunción con ARN-ss, una extensa validación experimental se justifica con el fin de identificar genes candidatos verdaderos positivos ^18. Reacción en cadena de la polimerasa transcrita inversa cuantitativa (QRT-PCR) es el método más comúnmente utilizado y óptima en la validación de los candidatos obtenidos a partir de análisis de ARN-Seq ^20. El objetivo de este trabajo es proporcionar una metodología sólida para investigar los perfiles de empalme relacionados con la resistencia a los fármacos en tumores sólidos y neoplasias hematológicas. Nuestro enfoque utiliza ARN-ss-a base de perfiles de transcriptoma de los modelos de líneas celulares seleccionadas de cánceres resistentes a los fármacos en combinación con un método de QRT-PCR establecido para la validación de genes candidatos implicados en la resistencia a los medicamentos.

<p class = "jove_content"> Los modelos de líneas celulares de leucemia humana utilizados en este estudio incluyen pediátrica de células T leucemia linfoblástica aguda (LLA-T) línea celular CCRF-CEM (CEM-WT), sus dos glucocorticoides (GC) -resistant subclones CEM -C7H2-R5C3 (CEM-C3) y CEM-C7R5 (CEM-R5) ^21,22 y el metotrexato (MTX) sublínea -resistant CEM / R30dm ^23. Aunque las terapias actuales basados ​​en GCs y MTX establecen beneficio clínico en aproximadamente 90% de los casos, la aparición de GC-resistencia representa todavía un problema sin resolver con un mecanismo molecular poco clara. Para aislar GC resistente sub-clones, las células CEM-WT se cultivaron en 1 dexametasona mu M (Dex) de 2 a 3 semanas. sublínea resistente a MTX-CEM / R30dm se desarrolló a través de corto plazo repetida (24 horas) la exposición de las células CEM-peso a 30 M MTX como un imitador de protocolos clínicos. Curiosamente, esta línea celular también muestra resistencia cruzada a Dex (resultados no publicados) para el cual el mecanismo no se entiende completamente.

El sólido tumo modelo investigado en el presente estudio es el adenocarcinoma ductal pancreático, conocido por su extraordinaria refractariedad a la quimioterapia. Con este fin, se seleccionaron línea Panc-1 célula y su gemcitabina resistente sub-clon Panc-1R obtenido por incubación continua con 1 M de la droga ^24. Aquí se describe un enfoque para descubrir nuevos mecanismos subyacentes in vitro resistencia a los medicamentos mediante la combinación de tres protocolos: los ensayos de citotoxicidad colorimétricos para evaluar la sensibilidad al fármaco en las células leucémicas y células cancerosas de los tumores sólidos, tubería de ARN-basada en la SEC para identificar nuevas variantes de empalme relacionados con sensibilidad a los fármacos / resistencia y RT-PCR y análisis de QRT-PCR para validar los posibles candidatos.

Protocol

1. Caracterización de los perfiles de resistencia a los medicamentos a través de Ensayos de citotoxicidad Leucémica Cultura línea celular Mantener el parental de células T línea celular CCRF-CEM (CEM-WT), así como sus sublíneas resistentes a los fármacos, incluyendo CEM / R30dm, CEM-R5 y CEM-C3, en 25 cm 2 en medio de 10 ml de RPMI-1640 que contiene 2,3 M de ácido fólico suplementado con 10% de suero fetal de ternera y 100 unidades / ml de penicilina G y 100 mg …

Representative Results

Los ensayos de citotoxicidad descritos en el protocolo proporcionan un método fiable y robusto para evaluar la resistencia de las células cancerosas a los agentes quimioterapéuticos in vitro. Mediante el ensayo de MTT, se determinó la sensibilidad a la Dex en cuatro líneas T-ALL de células, incluyendo las células CEM-WT parentales Dex-sensibles, y tres sublíneas Dex-resistentes: CEM / R30dm, CEM-R5 y CEM-C3. Dos rangos de concentración diferentes tuvieron que ser utiliz…

Discussion

Aquí se describe un nuevo método que combina las técnicas de detección de citotoxicidad bien establecidos y de gran alcance transcriptómica basada en NGS análisis para identificar los eventos de corte y empalme diferencial en relación con la resistencia a fármacos. Ensayos espectrofotométricos son de alto rendimiento métodos convenientes y robustas para evaluar la sensibilidad a fármacos en modelos de cáncer in vitro y representan la primera opción para muchos laboratorios que realizan pruebas de d…

Materials

Sulforhodamine B	Sigma-Aldrich	230162
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	251399
CCRF-CEM	ATCC, Manassas, VA, USA	ATCC CCL-119
Panc-1	ATCC, Manassas, VA, USA	ATCC CRL-1469
DMEM high glucose	Lonza, Basel, Switzerland	12-604F
RPMI-1640	Gibco, Carlsbad, CA, USA	11875093
Fetal bovine and calf serum	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	758093
penicillin G streptomycin sulphate	Gibco, Carlsbad, CA, USA	15140122
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane	Sigma Aldrich	252859
MTT formazan	Sigma Aldrich	M2003
Anthos-Elisa-reader 2001	Labtec, Heerhugowaard, Netherlands		UV-Vis 96-well plate spectrophotometer
Greiner CELLSTAR 96 well plates	Greiner/Sigma	M0812-100EA
Trypsin/EDTA Solution 100 ml	Lonza, Basel, Switzerland	CC-5012
CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	82051-074
CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	82050-856
Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%)	B.Braun Melsungen AG, Germany	362 3140