İlaç Direnci İlgili Roman Splice türevlerini algılamak için RNA sıralamayı kullanarak<em> İn Vitro</em> Kanser Modelleri
Summary
Burada katı tümörler ve hematolojik malignitelerde ilaç direnci üzerinde anormal yapıştırma etkisini araştıran amaçlayan bir protokol açıklar. Bu hedefe, biz RNA seq ile ebeveyn ve in vitro dirençli modellerin transkriptomik profillerini analiz ve aday genler doğrulamak için bir QRT-PCR tabanlı bir yöntem kurdu.
Abstract
İlaç direnci hematolojik malignanlıklar ve katı tümörlerin her ikisi için, kanser tedavisinde önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. Intrinsik ya da kazanılmış direnci artan ilaç eleme dahil mekanizmalar, bir dizi neden olabilir, ilaç alımını, ilaç inaktivasyonunu ilaç hedefleri değişiklikler azalmıştır. Son veriler, diğer daha iyi bilinen genetik (mutasyon, amplifikasyonu) ve epigenetik (DNA hipermetilasyonu histon post-translasyonel modifikasyon) modifikasyonlarla, ilaç direnci mekanizması, aynı zamanda birleştirme sapmaları ile düzenlenir olabileceğini göstermiştir. Bu daha etkili tedavi yaklaşımları planlamak için gelecekte dikkat edilmesi gereken soruşturma hızla büyüyen bir alandır. Bu yazıda anlatılan protokol solid tümörler ve hematolojik malignitelerde ilaç direnci üzerinde anormal yapıştırma etkisini araştıran hedefleniyor. Bu hedefe, biz RNA seq ve kurmak yoluyla in vitro modellerinde bazılarının transkriptomik profillerini analized bir QRT-PCR tabanlı yöntem aday genleri doğrulamak için. Özellikle, DDX5 ve PKM'si kopyasının farklı kesilmesinden değerlendirildi. hesaplamalı araç PASPASLARI tarafından tespit edilen anormal yapıştırma farklı DDX5 ekleme varyantları ebeveyn vs dirençli hücrelerde ifade gösteren, lösemi hücrelerinde doğrulanmıştır. Bu hücrelerde, daha da gemsitabin maruz kalma ile tetiklenen ilaç direnci farklı mekanizmayı göstermektedir ebeveyn Panc-1 hücreleri ile karşılaştırıldığında Panc-1 gemsitabin dayanıklı muadili saptanmadı yüksek Pkm2 / PKM1 oranı, gözlendi.
Introduction
Kanser tedavisinde, kemoterapi malign hücrelerin direnci, ya içsel ya da uzun süreli ilaç maruziyeti üzerine edinilen önemli gelişmelere rağmen, lösemi ve solid tümörlerin 1 geniş bir yelpazede tedavi başarısızlığı için en önemli nedenidir.
In vitro hücre hattı modellerinde ilaç direncini altında yatan mekanizmaları nitelendirmek için kemoterapötik maddelerin dirençli kanser hücrelerinin adım adım seçimi ile geliştirilir. Bu prosedür klinik ortamlarda kullanılan rejimleri taklit ve bu nedenle ilgili direnç mekanizmaları derinliği soruşturma sağlar. Tedavi hayatta dirençli hücreler daha sonra hücre canlılığı / sitotoksisite deneyleri 2 kullanılarak ebeveyn duyarlı hücrelerden ayırt edilir. Birincil hücrelerin in vitro ilaç direnci profilleri kemoterapi 3 klinik yan önemli ilgili olduğu gösterilmiştir.
Yüksek verim cytotoxicity deneyler, in vitro ilaç duyarlılığını belirlemek için uygun bir yöntem teşkil etmektedir. Burada, hücre canlılığı ile değerlendirilir, örneğin 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil tetrazolyum bromür – yani, belirli alt tabakalar metabolik dönüşüm (dayanır MTT deneyi 4, böylece, hücrelerin mitokondrial faaliyeti yansıtan renkli ürünlere tetrazolyum tuzlarının kullanımı). Alternatif olarak, hücresel protein içeriğini sülforhodamin B (SRB) deneyi 5 kullanılarak belirlenebilir. Burada, yaşayabilir hücrelerin sayısı gerek olmadan, bir spektrofotometre, uygun bir dalga boyunda ölçülen optik yoğunluk (OD) ile orantılıdır yaygın ve zaman alıcı bir hücre sayımı işlemleri. Belirli bir kemoterapötik ilaç ile uyarılan büyüme inhibisyonu hücreleri test maddesi ile muamele edilmiş ve muamele edilmemiş kontrol hücrelerinin OD ile karşılaştırıldığı kuyu OD göre hesaplanabilir. Bir doz-tepki eğrisi obta olankontrol hücrelerine göre canlı hücre yüzdeleri karşılık ilaç konsantrasyonu işaretlenmesiyle çağırın. Son olarak, ilaç duyarlılığı tedavi edilmemiş hücrelere (IC50) ile kıyaslandığında hücre büyüme inhibisyonu% 50 ile sonuçlanan konsantrasyon olarak kaydedilmiştir.
ilaç direncinin altında yatan mekanizmalar, ilaç etkinliği ve hücresel metabolizma belirleyicilerinin gen ifadesini etkileyen değişiklikler gibi pek çok farklı anormallikleri içerir. Mutasyonlar, aberasyonların bir transkripsiyonel olarak ve post-transkripsiyonel seviyede yanı sıra rahatsız epigenetik düzenlemeler de dahil olmak üzere, bu moleküler lezyonlar genellikle ilaç metabolizması ya da apoptoz 6 ya oynayan genleri etkiler.
Alternatif pre-mRNA ekleme ve karmaşık düzenleme son zamanlarda kanser hücrelerinin 7 ilaç direnci dikte edebilir bir roman varlık olarak önem aldık. İnsan genlerinin% 95 a kadar, alternatif olarak, bu aracılığıyla normal hücrelerde birleştirilirAynı genin birçok farklı protein izoformları üreten sıkıca düzenlenmiş süreç. Alternatif yapıştırma genellikle kanser deregüle ve birkaç tümör ilaç metabolizmasında (örn, deoksisitidin kinaz, folylpolyglutamate sintetaz, veya çoklu ilaç direnci proteini) 6,8 katılan genlerin artan sayıda değişik ekleme mekanizması ile karakterize edilir. Bununla birlikte, ilaç dirençli hücrelerin yapıştırma profillerinin kapsamlı bir analiz acı eksiktir. Nedenle, bir alternatif birleştirme analizi için yüksek verimli yöntemlerin geliştirilmesi zorunludur. Bu daha etkili tedavi yaklaşımları geliştirmeye yardımcı olabilir.
Son on yılda, yeni nesil dizileme (NGS) teknolojilerinin hızla gelişmesi genom ifade düzenlenmesini ve çeşitli biyolojik süreçler 9 rollerini yöneten moleküler mekanizmaları içine yeni anlayışlar ile biyomedikal araştırmalar zenginleştirdi. RNA dizi (RNA DİZ) güçlü bir alt uygulamadırtranskriptomik alanında NGS arasında. Bu, miRNA, siRNA ve diğer küçük RNA (nitelik ve nicelik) aynı anda binlerce gen ifadesi desen bir genom profil izin verir ve iyi roman kodlama mRNA karakterizasyonu için uygun hem de uzun olmayan kodlama RNA sınıflar (örneğin, snRNA ve piRNA) 10,11.
RNA Seq transcriptome karakterizasyonu (örneğin, Sanger dizileme ve anlatım mikroarray'ler) önceki teknolojilere göre birçok avantajı vardır. Bu mevcut genom açıklama dayalı değildir, bu kararın bir tek nükleotid düzeyi vardır ve ekspresyon seviyesi tahmini için daha geniş bir dinamik aralığı vardır. Kısaca, RNA DİZ deneyler temel deneysel akışı cDNA kütüphane yapımı ve son olarak, yoğun paralel derin sıralama 12,13 dönüşüm ve ardından poliadenile transkript (mRNA) seçimi ve parçalanma meydana gelir. Nedeniyle sequencin hızlı düşüşSon birkaç yıldır, RNA-seq üzerinde g maliyetleri yavaş yavaş diğer teknolojiler yerini almaktadır ve önemli çabalar kütüphane hazırlık protokolleri geliştirmek için yapılıyor. Örneğin, deoksiüridin trifosfat (dUTP) ve önceki PCR amplifikasyonu, urasil-DNA glycosilase (Yeraltı) ile işaretli olan iplikçik sindirilmesi ile ikinci dizi cDNA, işaretleyerek mRNA transkriptlerinin şerit bilgilerini korumak için mümkündür. Bu süreç ekspresyon düzeyleri 14,15 gen açıklama ve tahmin doğruluğunu artırır.
Analiz ve RNA-seq verilerin yorumlanması biyoinformatik boru hatları 16,17 içinde karmaşık ve güçlü hesaplama yazılım paketleri ve işlem gerektiren. İlk olarak, ham sıkı kalite gereksinimlerini ulaşamayan dizileri, teknik ve biyolojik eserlerin çıkarılması ve atılması (kesim) tarafından kalite kontrol sürecinden okur. Daha sonra bir referans genom eşleştirilir ve endekslidir her bir örnek için okurGen düzeyinde, ekson düzey ya da transkript düzeyinde içine sırayla her kategorinin bolluğu belirlemek için. Uygulamaya bağlı olarak, rafine edilmiş veriler daha sonra alel-spesifik ekspresyonu, alternatif uç uca eklenmesi gen füzyonu ve tek nükleotid polimorfizmlerin (SNP), 12 tanımlanması için istatistiksel model hesaplanmıştır. Son olarak, seçilen seviyeye (yani, gen ekspresyonu veya alternatif ayırma) ile diferansiyel analizi, farklı koşullar altında elde edilen örnekleri karşılaştırma için kullanılabilir.
Diferansiyel yapıştırma analizi iki örnek arasındaki ekleme sitesi kullanımında farklar açıklanır. Bu amaçla ayrılmış yazılım paketleri giderek artan sayıda, farklı istatistiksel modeller, performans ve kullanıcı arayüzü 18 dayalı bulunmaktadır. Bunlar arasında, PASPASLAR (Transkript yapıştırma değişkenli Analizi) Bayes istatistiksel çerçeveye dayalı bir serbestçe kullanılabilir ve kesin hesaplama aracı olarak ortaya çıkmaktadır ve farklılık sorumluluk yönün tespit etmek için tasarlanmıştek veya eşli uç RNA-seq veri birinden rential yapıştırma olayları. Hizalanmış (.bam) dosyaları başlayarak, MATS alternatif birleştirme olayları tüm önemli türleri algılayabilir (ekson atlama, alternatif 3 'splice site alternatif 5' splice site birbirini dışlayan ekson ve intron tutma – Ayrıca bakınız Şekil 1).
İlk olarak, yazılım tanımlar örneğin ekson atlama için, belirli bir ekleme olayı destekleyen okur ve iki tip bunları sınıflandırır. incelenen ekson içinde harita ve belirli ekson ve iki memba ve mansap yan ekzon arasındaki kavşaklar yayılan (kanonik ekleme olayı için) "İçerme okur". İki yan ekzon arasındaki kavşak yayılan (alternatif bağlantı olayı için) "atlanıyor okur". Daha sonra, MATS hem kurallı ve alternatif etkinlikler için normalize içerme seviyesini döndürür ve numune veya koşulları arasındaki değerleri karşılaştırır. Sonuçta, bu P-değeri a hesaplarnd yanlış keşif oranı (FDR) iki durum arasında bir genin varyantı oranında fark her ekleme olayı 19,34 için belirli bir kullanıcı tanımlı eşiği aşan varsayarak.
RNA seq ile birlikte diferansiyel yapıştırma analizi takiben, geniş bir deneysel doğrulama gerçek pozitif gen adayları 18 belirlemek için garanti edilir. Kantitatif ters transkribe-polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) RNA Sekans analizi 20 elde edilen aday doğrulama en yaygın olarak kullanılan ve en iyi yöntemdir. Bu yazının amacı solid tümörlerin ve hematolojik malignitelerde ilaç direnci ile ilişkili birleştirme profilleri araştırmak için sağlam bir metodoloji sağlamaktır. Yaklaşımımız ilaç direnci belirtilen genler onaylanması için kurulmuş bir QRT-PCR yöntemi ile kombinasyon halinde ilaç dirençli kanser seçilen hücre hattı model RNA seq göre transcriptome profil kullanmaktadır.
<p class = "jove_content"> Bu çalışmada kullanılan insan lösemi hücre hattı modelleri çocuk T hücre akut lenfoblastik lösemi dahildir (T-ALL) hücre çizgisi CCRF-CEM (CEM-WT), iki glukokortikoid (GC) dayanıklı alt klonlar CEM -C7H2-R5C3 (CEM-C3) olup, CEM-C7R5 (CEM-R5) 21,22 ve metotreksat (MTX) -dirençli subline CEM / R30dm 23. GCS, MTX göre mevcut tedaviler vakaların yaklaşık% 90, klinik fayda oluşturulması da, GC-direnç ortaya hala açık molekül mekanizma ile çözülmemiş bir sorun teşkil etmektedir. GC dayanıklı alt klonları izole etmek için, CEM-WT, hücreler, 2 ila 3 hafta içinde 1 uM deksametazon (Dex) 'de kültürlenmiştir. MTX dirençli subline CEM / R30dm tekrarlanan kısa dönem (24 saat) klinik protokollere bir taklit olarak 30 uM MTX CEM-WT hücrelerinin maruz kalma yoluyla geliştirilmiştir. İlginç bir şekilde, Bu hücre hattı ayrıca mekanizması tam olarak anlaşılmış değildir olan Dex çapraz direnç (yayınlanmamış sonuçlar) görülür.katı tumya da bu çalışmada incelenen modelin kemoterapiye olağanüstü refrakterliği için ünlü pankreatik duktal adenokarsinom vardır. Bu amaçla, Panc-1 hücre çizgisi ve ilaç 24 1 uM sürekli inkübe etmek suretiyle elde edilen kendi gemsitabin dayanıklı alt klon Panc-1 R seçilir. Burada üç protokolleri birleştirerek in vitro ilaç direnci yatan yeni mekanizmalarını keşfetmek için bir yaklaşım açıklanmaktadır: kolorimetrik sitotoksisite deneyleri ile ilgili yeni uç uca eklenen varyantları belirlemek için lösemik hücreler ve katı tümörler, RNA seq göre boru kanser hücrelerindeki ilacın duyarlılığını değerlendirmek için ilaç duyarlılık / direnç ve RT-PCR ve QRT-PCR analizi potansiyel adayları doğrulamak için.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada ilaç direnci ile ilişkili olarak farklı birleştirme olayları tanımlamak için analizler köklü sitotoksisite tarama teknikleri ve güçlü NGS tabanlı transkriptomik birleştiren yeni bir yaklaşım açıklar. Spektrofotometrik analizler, in vitro kanser modellerinde ilaç duyarlılığını değerlendirmek için uygun ve sağlam yüksek verimlilik yöntemleri ve sitotoksisite gösterimleri yapan birçok laboratuvarlar için ilk tercih etmektedir. Bu yöntem için Giderme yanı sıra olası varya…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge prof. J.J. McGuire, prof. R. Kofler and dr. K. Quint for providing the resistant cell lines used in this work. The study has been founded by grants from Cancer Center Amsterdam (CCA) Foundation (to JC, EG and RS), the KiKa (Children Cancer-free grant for AW) foundation, the Law Offices of Peter G. Angelos Grant from the Mesothelioma Applied Research Foundation (to VEG and EG), Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC), Istituto Toscano Tumori (ITT), and Regione Toscana Bando FAS Salute (to EG).
Materials
| Sulforhodamine B | Sigma-Aldrich | 230162 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 251399 | |
| CCRF-CEM | ATCC, Manassas, VA, USA | ATCC CCL-119 | |
| Panc-1 | ATCC, Manassas, VA, USA | ATCC CRL-1469 | |
| DMEM high glucose | Lonza, Basel, Switzerland | 12-604F | |
| RPMI-1640 | Gibco, Carlsbad, CA, USA | 11875093 | |
| Fetal bovine and calf serum | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 758093 | |
| penicillin G streptomycin sulphate | Gibco, Carlsbad, CA, USA | 15140122 | |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Sigma Aldrich | 252859 | |
| MTT formazan | Sigma Aldrich | M2003 | |
| Anthos-Elisa-reader 2001 | Labtec, Heerhugowaard, Netherlands | UV-Vis 96-well plate spectrophotometer | |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Greiner/Sigma | M0812-100EA | |
| Trypsin/EDTA Solution 100 ml | Lonza, Basel, Switzerland | CC-5012 | |
| CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2 | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 82051-074 | |
| CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3 | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 82050-856 | |
| Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%) | B.Braun Melsungen AG, Germany | 362 3140 |
References
- Gottesman, M. M. Mechanisms of cancer drug resistance. Annu Rev Med. 53, 615-627 (2002).
- McDermott, M., et al. In vitro Development of Chemotherapy and Targeted Therapy Drug-Resistant Cancer Cell Lines: A Practical Guide with Case Studies. Front Oncol. 4, 40 (2014).
- Kaspers, G. J., et al. Prednisolone resistance in childhood acute lymphoblastic leukemia: vitro-vivo correlations and cross-resistance to other drugs. Blood. (1), 259-266 (1998).
- van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: the MTT assay. Methods Mol Biol. 731, 237-245 (2011).
- Vichai, V., Kirtikara, K. Sulforhodamine B colorimetric assay for cytotoxicity screening. Nat Protoc. 1 (3), 1112-1116 (2006).
- Wojtuszkiewicz, A., Assaraf, Y. G., Maas, M. J., Kaspers, G. J., Jansen, G., Cloos, J. Pre-mRNA splicing in cancer: the relevance in oncogenesis, treatment and drug resistance. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 673-689 (2015).
- Liu, S., Cheng, C. Alternative RNA splicing and cancer. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (5), 547-566 (2013).
- Wojtuszkiewicz, A., et al. Folylpolyglutamate synthetase splicing alterations in acute lymphoblastic leukemia are provoked by methotrexate and other chemotherapeutics and mediate chemoresistance. Int J Cancer. 138 (7), 1645-1656 (2016).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 10, 1135-1145 (2008).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 1, 57-63 (2009).
- Ozsolak, F., Milos, P. M. RNA sequencing: advances, challenges and opportunities. Nat Rev Genet. 2, 87-98 (2011).
- Han, Y., Gao, S., Muegge, K., Zhang, W., Zhou, B. Advanced Applications of RNA Sequencing and Challenges. Bioinform Biol Insights. 9 (Suppl 1), 29-46 (2015).
- Khatoon, Z., Figler, B., Zhang, H., Cheng, F. Introduction to RNA-Seq and its applications to drug discovery and development. Drug Dev Res. 5, 324-330 (2014).
- Zhao, S., et al. Comparison of stranded and non-stranded RNAseq transcriptome profiling and investigation of gene overlap. BMC Genomics. 16, 675 (2015).
- Carrara, M., et al. Alternative splicing detection workflow needs a careful combination of sample prep and bioinformatics analysis. BMC Bioinformatics. 16 (Suppl 9), (2015).
- Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).
- Wang, L., Wang, S., Li, W. RSeQC: quality control of RNA-seq experiments. Bioinformatics. 28, 2184-2185 (2012).
- Hooper, J. E. A survey of software for genome-wide discovery of differential splicing in RNA-Seq data. Hum Genomics. 8, (2014).
- Shen, S., et al. MATS: a Bayesian framework for flexible detection of differential alternative splicing from RNA-Seq data. Nucleic Acids Res. 8, e61 (2012).
- Vargas, I. M., Vivas-Mejìa, P. E. Assessment of mRNA splice variants by qRT-PCR. Methods Mol Biol. 1049, 171-186 (2013).
- Hala, M., Hartmann, B. L., Böck, G., Geley, S., Kofler, R. Glucocorticoid-receptor-gene defects and resistance to glucocorticoid-induced apoptosis in human leukemic cell lines. Int J Cancer. 68 (5), 663-668 (1996).
- Schmidt, S., et al. Glucocorticoid resistance in two key models of acute lymphoblastic leukemia occurs at the level of theglucocorticoid receptor. FASEB J. 20 (14), 2600-2602 (2006).
- McCloskey, D. E., McGuire, J. J., Russell, C. A., Rowan, B. G., Bertino, J. R., Giuseppe Pizzorno, G., et al. Decreased folylpolyglutamate synthetase activity as a mechanism of methotrexate resistance in CCRF-CEM human leukemia sublines. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6181-6187 (1991).
- Quint, K., et al. Pancreatic cancer cells surviving gemcitabine treatment express markers of stem cell differentiation and epithelial-mesenchymal transition. Int J Oncol. 41 (6), 2093-2102 (2012).
- Lin, S., et al. DDX5 is a positive regulator of oncogenic NOTCH1 signaling in T cell acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 32 (40), 4845-4853 (2013).
- Mazurek, A., et al. Acquired dependence of acute myeloid leukemia on the DEAD-box RNA helicase DDX5. Cell Rep. 7 (6), 1887-1899 (2014).
- Calabretta, S., et al. Modulation of PKM alternative splicing by PTBP1 promotes gemcitabine resistance in pancreatic cancer cells. Oncogene. , (2016).
- Azoitei, N., et al. PKM2 promotes tumor angiogenesis by regulating HIF-1α through NF-κB activation. Mol Cancer. 15 (1), (2016).
- Samuels, A. L., Heng, J. Y., Beesley, A. H., Kees, U. R. Bioenergetic modulation overcomes glucocorticoid resistance in T-lineage acute lymphoblastic leukaemia. Br J Haematol. 165 (1), 57-66 (2014).
- Rots, M. G., Pieters, R., Kaspers, G. J., Veerman, A. J., Peters, G. J., Jansen, G. Classification of ex vivo methotrexate resistance in acute lymphoblastic and myeloid leukaemia. Br J Haematol. 110 (4), 791-800 (2000).
- Funel, N., et al. Laser microdissection and primary cell cultures improve pharmacogenetic analysis in pancreatic adenocarcinoma. Lab Invest. 88 (7), 773-784 (2008).
- Gillet, J. P., et al. Redefining the relevance of established cancer cell lines to the study of mechanisms of clinical anti-cancer drug resistance. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18708-18713 (2011).
- Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nat Rev Drug Discov. 11 (2), 125-140 (2012).
- Shen, S., et al. rMATS: robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), E5593-E5601 (2014).
