に薬剤耐性に関連する新規スプライス変異体を検出するために、RNA配列決定を使用して、<em>インビトロ</em>がんモデル
Summary
ここでは、固形腫瘍および血液悪性腫瘍における薬剤耐性に異常なスプライシングの影響を調査することを目的とプロトコルについて説明します。この目標のために、我々は、RNA-seqのを介してin vitroモデルにおける親及び抵抗性のトランスクリプトームプロフィールを分析し、候補遺伝子を検証するための定量RT-PCRベースの方法を確立しました。
Abstract
薬剤耐性は、血液悪性腫瘍および固形腫瘍の両方のために、癌の治療における主要な問題です。内因性または抵抗が大きく薬物除去を含む、メカニズムの範囲によって引き起こされる可能性が取得された、薬物摂取、薬物の不活性化、および薬物標的の変化を減少させました。最近のデータは、他よりはよく知られている遺伝子（突然変異、増幅）およびエピジェネティックな（DNAの過剰メチル化、ヒストンの翻訳後修飾）修飾により、薬物耐性の機構はまた、スプライシング異常によって調節されるかもしれないことを示しました。これは、より効果的な治療法を計画するために、将来の注目に値する研究の急速に成長している分野です。この論文に記載されているプロトコルは、固形腫瘍および血液悪性腫瘍における薬剤耐性に異常なスプライシングの影響を調査することを目的とします。この目標のために、我々は、RNA-seqのを介してin vitroモデルにおけるいくつかのトランスクリプトームのプロファイルを分析し、確立しますED定量RT-PCRに基づく方法は、候補遺伝子の妥当性を検証します。特に、我々はDDX5とPKM転写産物の差動スプライシングを評価しました。計算ツールマットによって検出された異常なスプライシングが異なるDDX5スプライス変異体は、親対抵抗性細胞において発現されることを示し、白血病細胞において確認されました。これらの細胞では、我々はまた、ゲムシタビン曝露によって誘発される薬剤耐性の異なるメカニズムを示唆し、親PANC-1細胞と比較して、PANC-1、ゲムシタビン耐性の対応では検出されなかった高いPKM2 / PKM1比を、観察しました。
Introduction
癌治療、化学療法に対する悪性細胞の抵抗、いずれかの真性または長期の薬物曝露の際に取得にかなりの進歩にもかかわらず、白血病および固形腫瘍1の広い範囲で治療失敗の主な理由です。
薬剤耐性の機序を描写するために、 インビトロ細胞株モデルにおいて化学療法剤に耐性の癌細胞の段階的な選択によって開発されています。この手順は、臨床現場で使用される体制を模倣し、従って、関連する耐性機構の深さ調査にできます。処置を生き延びる耐性細胞は、次いで、細胞生存性/細胞毒性アッセイ2を使用して、親の感受性細胞と区別されます。初代細胞のインビトロでの薬剤耐性プロファイルに化学療法3に対する臨床応答に有意に関連することが示されています。
ハイスループットcytotoxicityアッセイは、in vitroでの薬剤感受性を決定するための便利な方法を構成しています。本明細書において、細胞の生存率は、によって評価される、例えば、3- [4,5-ジメチルチアゾール-2-イル] -2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド- すなわち 、特定の基質の代謝的変換（に基づいているMTTアッセイ4、それによって、細胞のミトコンドリア活性を反映して着色された製品へのテトラゾリウム塩）、。あるいは、細胞のタンパク質含有量は、スルホローダミンB（SRB）アッセイ5を用いて定量することができます。ここでは、生存細胞の数は、必要とせず、分光光度計に適切な波長で測定した光学密度（OD）に比例します 広範かつ時間のかかる細胞計数手順を。特定の化学療法剤によって誘導される成長阻害は、細胞が、試験薬剤で処理し、未処理対照細胞のODと比較したウェルのODに基づいて計算することができます。用量反応曲線はobtaあります細胞を制御するために相対生存細胞の割合対薬物濃度をプロットすることによりINED。最後に、薬物感受性は、未処理細胞（IC 50）と比較して細胞増殖阻害の50％を生じる濃度として報告することができます。
薬剤耐性のメカニズムは、薬物活性および細胞代謝の決定因子の遺伝子発現に影響を与える変化のような多くの異なる異常を含みます。突然変異、異常な転写時および転写後レベルだけでなく、邪魔エピジェネティック制御を含むこれらの分子の病変は、多くの場合、薬物代謝やアポトーシス6のいずれかに関与する遺伝子に影響を与えます。
代替的なプレmRNAスプライシング、その複雑な調節は、最近、癌細胞7の薬剤耐性を決定することができる新規な実体としてかなりの注目を集めています。ヒト遺伝子の95％までの代わりにこのによって正常細胞にスプライスされ同じ遺伝子から多くの異なるタンパク質アイソフォームを生成しっかりと調節されたプロセス。選択的スプライシングは、多くの場合、癌において調節解除され、いくつかの腫瘍は、薬物代謝に関与する遺伝子の増加（ すなわち 、デオキシシチジンキナーゼ、葉酸ポリグルタミン酸合成酵素、または多剤耐性タンパク質）6,8の変化したスプライシングによって特徴付けられます。しかし、薬剤耐性細胞のスプライシングプロファイルの包括的な分析が痛いほど欠けています。したがって、選択的スプライシング分析のためのハイスループット方法を開発することが不可欠です。これは、より効果的な治療法の開発に役立つ可能性があります。
最後の十年の間に、次世代シーケンシング（NGS）技術の急速な発展は、ゲノム発現の調節および様々な生物学的プロセス9におけるそれらの役割を支配する分子メカニズムに新しい洞察力を持つ生物医学研究を豊かにしています。 RNAシーケンシング（RNA-seqの）強力なサブアプリケーションですトランスクリプトミクスの分野におけるNGSの。それは、同時に数千の遺伝子の発現パターンのゲノムワイドなプロファイリングを（定性的および定量的に）可能にし、新たなコーディングmRNAの特性評価だけでなく、長い非コードRNA、miRNAのは、siRNA、および他の小RNAに適していますクラス（ 例えば 、snRNAをとのpiRNA）10,11。
RNA-のSeqは、トランスクリプトームの特徴づけ（ 例えば、サンガー配列決定及び発現マイクロアレイ）の以前の技術に比べて多くの利点を持っています。これは、既存のゲノム注釈に基づいていない、それは解像度の単一ヌクレオチドのレベルを有し、それは、発現レベルの推定のための広いダイナミックレンジを有しています。簡単に言えば、RNA-seqの実験の基本的な実験的なワークフローは、cDNAへの変換、ライブラリー構築、最終的には、大規模並列深いシーケンシング12,13に続いて、ポリアデニル化転写産物（mRNAの）選択と断片から構成されています。 sequencinの急速な低下に起因しますここ数年、RNA-seqのオーバーグラムコストは徐々に他の技術を交換し、重要な努力がライブラリの準備プロトコルを改善するために行われています。例えば、デオキシウリジン三リン酸（dUTPを）を有する第二鎖cDNAをマークし、PCR増幅の前に、ウラシルDNA-グリコシラーゼ（UDG）でマークされた鎖を消化することによってmRNA転写物のストランド情報を保持することが可能になりました。このプロセスは、遺伝子アノテーションと発現レベル14,15の推定精度を向上させます。
RNA-seqのデータの分析および解釈は、バイオインフォマティクスパイプライン16,17内の複雑で強力な計算ソフトウェアパッケージおよび処理を必要とします。まず、生のは、厳しい品質要求に達しない配列を技術的、生物学的なアーティファクトを除去し、廃棄する（トリミング）により品質管理を受ける読み取ります。続いて参照ゲノムにマッピングされ、インデックスが作成されている各サンプルに対して読み取り、遺伝子レベル、エクソンレベル、または転写物レベルに、各カテゴリの豊富さを決定するためです。用途に応じて、精製されたデータは、対立遺伝子特異的な発現、スプライシング、遺伝子融合、および単一ヌクレオチド多型（SNP）12を識別するための統計的モデルを介して計算されます。最後に、選択されたレベル（ すなわち、遺伝子発現または選択的スプライシング）の微分解析は、異なる条件下で得られた試料を比較するために使用することができます。
異なるスプライシング分析は、2サンプル間のスプライス部位の使用状況の違いを説明しています。この目的のために捧げられたソフトウェアパッケージの増加数は異なる統計モデル、パフォーマンスやユーザーインターフェース18に基づいてご利用いただけます。これらの中でも、MATS（トランスクリプトスプライシングの多変量解析）はベイズ統計の枠組みに基づいて、自由に利用できると正確な計算ツールとして現れ、diffeを検出するように設計します単一またはペアエンドRNA-seqのデータからrentialスプライシング事象。整列（.bam）ファイルから出発して、MATSは、選択的スプライシング事象のすべての主要なタイプを検出することができます（エクソンスキッピング、代替3 'スプライス部位、代替5'スプライス部位、相互に排他的なエクソンおよびイントロン保持を-また、 図1を参照します）。
まず、ソフトウェアの識別は、例えばエクソンスキッピングのために、特定のスプライシングイベントをサポートする読み出し、二つのタイプにそれらを分類します。調べエクソン内にマッピングし、その特定のエキソンと2上流と下流の隣接するエクソンの間の接合部にまたがる（標準的なスプライスイベントのために）」包含読み取り」。 2つのフランキングエクソンの間の接合部にまたがる（選択的スプライシングイベントのために）「スキップ読み取り」。その後、マットは両方の正準および代替イベントのための正規化された含有レベルを返し、サンプルまたは条件の間の値を比較します。最終的には、P値Aを算出しますND偽発見率（FDR）は、二つの状態の間の遺伝子の変異率の差が各スプライシング事象19,34の指定されたユーザ定義のしきい値を超えたと仮定します。
RNA-seqのと併せて、差動スプライシング解析に続いて、大規模な実験的検証は真陽性遺伝子候補18を識別するために保証されています。定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（QRT-PCR）はRNA-、配列番号解析部20から得られた候補の検証の中で最も一般的に使用され、最適な方法です。本稿の目的は、固形腫瘍および血液悪性腫瘍における薬剤耐性関連のスプライシングプロファイルを調査するための堅牢な方法論を提供することにあります。我々のアプローチは、薬剤耐性に関与する候補遺伝子の検証のために確立された定量RT-PCR法と組み合わせた薬剤耐性癌の選択された細胞株モデルのRNA-配列に基づくトランスクリプトーム・プロファイリングを利用します。
<p clasS = "jove_content">本研究で用いたヒト白血病細胞株モデルは、小児T細胞急性リンパ芽球性白血病を含めた（T-ALL）細胞株CCRF-CEM（CEM-WT）、その2つのグルココルチコイド（GC）耐性サブクローンCEM -C7H2-R5C3（CEM-C3）とCEM-C7R5（CEM-R5）21,22およびメトトレキサート（MTX）耐性サブラインCEM / R30dm 23。 GCおよびMTXに基づいて、現在の治療法は、症例の約90％に臨床的有益性を確立しているが、GC-耐性の出現はまだ不明分子機構との未解決の問題を表します。 GC耐性サブクローンを単離するために、CEM-WT細胞は、2〜3週間、1μMのデキサメタゾン（Dexの）中で培養しました。 MTX耐性サブラインCEM / R30dmが繰り返さ短期（24時間）臨床プロトコルの模倣として30μMMTXへのCEM-WT細胞の曝露によって開発されました。興味深いことに、この細胞株はまた、メカニズムは完全には理解されていないデックスに対する交差耐性（未発表の結果）を表示します。固体TUMまたは本研究で検討したモデルは、化学療法への特別な耐火性のための悪名高い、膵管腺癌です。この目的のために、我々は、薬剤24の1μMで連続インキュベーションによって得られたPANC-1細胞株およびそのゲムシタビン耐性サブクローンPANC-1Rを選択しました。に関連する新規なスプライス変異体を同定するためのRNA配列ベースのパイプライン、固形腫瘍からの白血病細胞および癌細胞における薬剤感受性を評価するために、比色細胞毒性アッセイ：ここでは、3つのプロトコルを組み合わせることによりインビトロ薬剤耐性の基礎となる新規のメカニズムを発見する方法を説明します薬剤感受性/抵抗およびRT-PCRおよび定量RT-PCR分析は、潜在的な候補者の妥当性を検証します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、十分に確立された細胞毒性のスクリーニング技術を組み合わせて、強力なNGSベースのトランスクリプトームは、薬剤耐性に関連する差動スプライシング事象を識別するために分析する新規な方法を記載します。分光光度アッセイは、in vitroでの癌モデルにおける薬剤感受性を評価するための便利で堅牢なハイスループット法であり、細胞毒性スクリーニングを行う多くの研?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge prof. J.J. McGuire, prof. R. Kofler and dr. K. Quint for providing the resistant cell lines used in this work. The study has been founded by grants from Cancer Center Amsterdam (CCA) Foundation (to JC, EG and RS), the KiKa (Children Cancer-free grant for AW) foundation, the Law Offices of Peter G. Angelos Grant from the Mesothelioma Applied Research Foundation (to VEG and EG), Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC), Istituto Toscano Tumori (ITT), and Regione Toscana Bando FAS Salute (to EG).
Materials
| Sulforhodamine B | Sigma-Aldrich | 230162 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 251399 | |
| CCRF-CEM | ATCC, Manassas, VA, USA | ATCC CCL-119 | |
| Panc-1 | ATCC, Manassas, VA, USA | ATCC CRL-1469 | |
| DMEM high glucose | Lonza, Basel, Switzerland | 12-604F | |
| RPMI-1640 | Gibco, Carlsbad, CA, USA | 11875093 | |
| Fetal bovine and calf serum | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 758093 | |
| penicillin G streptomycin sulphate | Gibco, Carlsbad, CA, USA | 15140122 | |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Sigma Aldrich | 252859 | |
| MTT formazan | Sigma Aldrich | M2003 | |
| Anthos-Elisa-reader 2001 | Labtec, Heerhugowaard, Netherlands | UV-Vis 96-well plate spectrophotometer | |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Greiner/Sigma | M0812-100EA | |
| Trypsin/EDTA Solution 100 ml | Lonza, Basel, Switzerland | CC-5012 | |
| CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2 | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 82051-074 | |
| CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3 | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 82050-856 | |
| Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%) | B.Braun Melsungen AG, Germany | 362 3140 |
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