उपन्यास ब्याह वेरिएंट में दवा प्रतिरोध करने के लिए संबंधित का पता लगाने के लिए शाही सेना अनुक्रमण का उपयोग<em> इन विट्रो</em> कैंसर मॉडल
Summary
यहाँ हम एक प्रोटोकॉल ठोस ट्यूमर और कैंसर hematological में दवा प्रतिरोध पर न्यायपालिका splicing के प्रभाव की जांच करने के उद्देश्य का वर्णन है। इस लक्ष्य के लिए, हम शाही सेना seq के माध्यम से माता पिता और इन विट्रो में प्रतिरोधी मॉडल के transcriptomic प्रोफाइल विश्लेषण किया है और उम्मीदवार जीन मान्य करने के लिए एक QRT- पीसीआर आधारित पद्धति की स्थापना की।
Abstract
ड्रग प्रतिरोध दोनों hematological कैंसर और ठोस ट्यूमर के लिए कैंसर के इलाज में एक बड़ी समस्या बनी हुई है। आंतरिक या अधिग्रहण प्रतिरोध वृद्धि की दवा उन्मूलन सहित तंत्र की एक श्रृंखला की वजह से हो सकता है, दवा तेज, दवा निष्क्रियता और नशीली दवाओं के लक्ष्यों के परिवर्तन में कमी आई है। हाल के आंकड़ों से पता चला है कि अन्य की तुलना में अच्छी तरह से जाना जाता है आनुवंशिक (उत्परिवर्तन, प्रवर्धन) और epigenetic (डीएनए hypermethylation, हिस्टोन बाद translational संशोधन) संशोधन के द्वारा, दवा प्रतिरोध तंत्र भी splicing aberrations द्वारा विनियमित किया जा सकता है। यह जांच कि आदेश में और अधिक प्रभावी चिकित्सकीय दृष्टिकोण की योजना बनाने में भविष्य ध्यान देने योग्य है की एक तेजी से बढ़ता क्षेत्र है। इस पत्र में वर्णित प्रोटोकॉल ठोस ट्यूमर और कैंसर hematological में दवा प्रतिरोध पर न्यायपालिका splicing के प्रभाव की जांच के उद्देश्य से है। इस लक्ष्य के लिए, हम शाही सेना seq और स्थापित के माध्यम से इन विट्रो मॉडल में कई की transcriptomic प्रोफाइल विश्लेषण कियाएड एक QRT- पीसीआर आधारित पद्धति उम्मीदवार जीन मान्य करने के लिए। विशेष रूप से, हम DDX5 और PKM टेप के अंतर splicing मूल्यांकन किया है। न्यायपालिका splicing कम्प्यूटेशनल उपकरण मैट द्वारा पता लगाया leukemic कोशिकाओं में मान्य किया गया था, दिखा रहा है कि विभिन्न DDX5 ब्याह वेरिएंट पैतृक बनाम प्रतिरोधी कोशिकाओं में व्यक्त कर रहे हैं। इन कोशिकाओं में, हम भी एक उच्च PKM2 / PKM1 अनुपात है, जो माता पिता का Panc-1 कोशिकाओं की तुलना में Panc-1 Gemcitabine प्रतिरोधी समकक्ष में पता नहीं था मनाया, दवा प्रतिरोध Gemcitabine जोखिम से प्रेरित का एक अलग तंत्र का सुझाव दे।
Introduction
कैंसर उपचार, रसायन चिकित्सा के लिए घातक कोशिकाओं की प्रतिरोध, या तो आंतरिक या लंबे समय तक दवा जोखिम पर हासिल कर लिया करने में काफी प्रगति के बावजूद, ल्यूकेमिया और ठोस ट्यूमर 1 की एक विस्तृत श्रृंखला में उपचार विफलता के लिए प्रमुख कारण है।
आदेश अंतर्निहित दवा प्रतिरोध तंत्र, इन विट्रो सेल लाइन मॉडल में चित्रित करने में एजेंटों के लिए प्रतिरोधी कैंसर की कोशिकाओं की चरणबद्ध सेलेक्शन विकसित कर रहे हैं। यह प्रक्रिया नैदानिक सेटिंग में इस्तेमाल किया व्यवस्थाओं mimics और इसलिए प्रासंगिक प्रतिरोध तंत्र की गहराई से जांच में अनुमति देता है। प्रतिरोधी कोशिकाओं जो उपचार के जीवित रहने तब सेल व्यवहार्यता / cytotoxicity assays 2 का उपयोग करके पैतृक संवेदनशील कोशिकाओं से प्रतिष्ठित हैं। प्राथमिक कोशिकाओं की इन विट्रो दवा प्रतिरोध प्रोफाइल में काफी कीमोथेरेपी से 3 नैदानिक प्रतिक्रिया से संबंधित होना दिखाया गया है।
उच्च throughput cytotoxicity assays इन विट्रो में दवा संवेदनशीलता का निर्धारण करने के लिए एक सुविधाजनक तरीका गठन। इस के साथ साथ, कोशिकाओं की व्यवहार्यता द्वारा मूल्यांकन किया है, उदाहरण के लिए 3 [4,5-dimethylthiazol-2-YL] -2,5-diphenyl tetrazolium ब्रोमाइड – MTT परख 4, जो कुछ substrates के चयापचय रूपांतरण (यानी के आधार पर किया जाता है, tetrazolium लवण) रंग उत्पादों में है, जिससे कोशिकाओं के mitochondrial गतिविधि को दर्शाती है। वैकल्पिक रूप से, सेलुलर प्रोटीन सामग्री sulforhodamine बी (एसआरबी) परख 5 का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। इधर, व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में एक उपयुक्त तरंग दैर्ध्य में मापा के लिए आनुपातिक है, की कोई जरूरत के साथ व्यापक और समय लेने वाली सेल गिनती प्रक्रियाओं। एक निश्चित chemotherapeutic दवा से प्रेरित विकास निषेध कुओं जो कोशिकाओं अनुपचारित नियंत्रण कक्षों के आयुध डिपो के साथ तुलना में एक परीक्षण एजेंट के साथ इलाज किया गया और के आयुध डिपो के आधार पर गणना की जा सकती है। एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र obta हैकोशिकाओं को नियंत्रित करने के रिश्तेदार व्यवहार्य कोशिकाओं के प्रतिशत की तुलना में दवा सांद्रता साजिश रचने के द्वारा ined। अंत में, दवा संवेदनशीलता एकाग्रता अनुपचारित कोशिकाओं (आईसी 50) की तुलना में है कि सेल विकास निषेध के 50% में परिणाम के रूप में सूचना दी जा सकती है।
अंतर्निहित तंत्र दवा प्रतिरोध ऐसी दवा गतिविधि और सेलुलर चयापचय के निर्धारकों के जीन की अभिव्यक्ति को प्रभावित करने परिवर्तन के रूप में कई अलग अलग असामान्यताओं, शामिल हैं। म्यूटेशन, aberrations एक ट्रांसक्रिप्शनल पर और बाद ट्रांसक्रिप्शनल स्तर के रूप में अच्छी तरह से परेशान epigenetic विनियमन सहित इन आणविक घावों, अक्सर या तो दवा चयापचय या apoptosis 6 में शामिल जीन प्रभावित करते हैं।
वैकल्पिक पूर्व mRNA splicing और अपनी जटिल विनियमन हाल ही में एक उपन्यास इकाई है कि कैंसर कोशिकाओं 7 की दवा प्रतिरोध हुक्म हो सकता है के रूप में काफी ध्यान दिया है। मानव जीन के 95% अप करने के लिए वैकल्पिक रूप से इस के माध्यम से सामान्य कोशिकाओं में spliced रहे हैंकसकर विनियमित प्रक्रिया है जो एक ही जीन से कई अलग अलग प्रोटीन isoforms पैदा करता है। वैकल्पिक splicing अक्सर कैंसर में नियंत्रण मुक्त किया जाता है और कई ट्यूमर दवा चयापचय (यानी, deoxycytidine काइनेज, folylpolyglutamate synthetase, या बहुऔषध प्रतिरोध प्रोटीन) 6.8 में शामिल जीनों की बढ़ती संख्या की बदल splicing की विशेषता है। हालांकि, दवा प्रतिरोधी कोशिकाओं की splicing प्रोफाइल के व्यापक विश्लेषण दर्द की कमी है। इसलिए, यह वैकल्पिक splicing विश्लेषण के लिए उच्च तरीकों को विकसित करने के लिए आवश्यक है। यह और अधिक प्रभावी चिकित्सकीय दृष्टिकोण विकसित करने में मदद कर सकता है।
पिछले दशक के दौरान, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) प्रौद्योगिकियों का तेजी से विकास जीनोम अभिव्यक्ति के नियमन और विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं 9 में उनकी भूमिका के शासी आणविक तंत्र में नए अंतर्दृष्टि के साथ जैव चिकित्सा अनुसंधान को समृद्ध बनाया है। शाही सेना अनुक्रमण (आरएनए-सेक) एक शक्तिशाली उप-अनुप्रयोग हैtranscriptomics के क्षेत्र में NGS की। यह एक जीनोम चौड़ा रूपरेखा (दोनों गुणात्मक और मात्रात्मक) एक साथ जीनों के हजारों की अभिव्यक्ति पैटर्न की अनुमति देता है और अच्छी तरह से उपन्यास कोडिंग mRNAs के लक्षण वर्णन के लिए अनुकूल है और साथ ही लंबे समय से गैर-कोडिंग आरएनए है, miRNA, siRNA, और अन्य छोटे आरएनए वर्गों (जैसे, snRNA और Pirna) 10,11।
शाही सेना Seq transcriptome लक्षण वर्णन (जैसे, सेंगर अनुक्रमण और अभिव्यक्ति प्रोटीन) के लिए पिछले प्रौद्योगिकियों पर कई फायदे हैं। यह मौजूदा जीनोम एनोटेशन पर आधारित नहीं है, यह संकल्प की एक एकल न्यूक्लियोटाइड स्तर है और यह अभिव्यक्ति के स्तर के आकलन के लिए एक व्यापक गतिशील रेंज है। संक्षेप में, शाही सेना seq प्रयोगों के बुनियादी प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह polyadenylated प्रतिलेख (mRNA) के चयन और विखंडन, सीडीएनए, पुस्तकालय निर्माण और अंत में, व्यापक समानांतर गहरी अनुक्रमण 12,13 में रूपांतरण के द्वारा पीछा के होते हैं। sequencin का तेजी से गिरावट की वजहपिछले कुछ वर्षों में, शाही सेना seq खत्म जी लागत धीरे-धीरे अन्य प्रौद्योगिकियों की जगह है और महत्वपूर्ण प्रयास पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल में सुधार के लिए किए जा रहे हैं। उदाहरण के लिए, यह अब डिऑक्सीयूरिडीन triphosphate (dUTP) और पीसीआर प्रवर्धन करने से पहले, uracil-डीएनए glycosilase (UDG) से चिह्नित कतरा पचाने के साथ दूसरे कतरा सीडीएनए अंकन द्वारा mRNA टेप का किनारा जानकारी बनाए रखने के लिए संभव है। इस प्रक्रिया जीन एनोटेशन और अभिव्यक्ति के स्तर 14,15 के आकलन की सटीकता को बढ़ाता है।
विश्लेषण और आरएनए seq डेटा की व्याख्या bioinformatic पाइपलाइनों 16,17 के भीतर जटिल और शक्तिशाली कम्प्यूटेशनल सॉफ्टवेयर संकुल और प्रसंस्करण की आवश्यकता है। सबसे पहले, कच्चे तकनीकी और जैविक कलाकृतियों दृश्यों जो कड़े गुणवत्ता की आवश्यकताओं तक पहुँच नहीं है हटाने और discarding (trimming) द्वारा गुणवत्ता नियंत्रण से गुजरना पढ़ता है। इसके बाद प्रत्येक नमूना के लिए पढ़ता है एक संदर्भ जीनोम के लिए मैप और अनुक्रमित रहे हैंजीन-स्तर, एक्सॉन-स्तर, या प्रतिलिपि-स्तर में, क्रम में प्रत्येक वर्ग की बहुतायत निर्धारित करने के लिए। आवेदन के आधार पर, परिष्कृत डेटा तो एलील विशिष्ट अभिव्यक्ति, वैकल्पिक splicing है, जीन fusions और एकल nucleotide बहुरूपताओं (SNPs) 12 की पहचान के लिए सांख्यिकीय मॉडल के माध्यम से गणना कर रहे हैं। अंत में, चयनित स्तर (यानी, जीन अभिव्यक्ति या वैकल्पिक splicing) पर अंतर विश्लेषण विभिन्न शर्तों के तहत प्राप्त नमूनों की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
विभेदक splicing विश्लेषण दो नमूनों के बीच ब्याह साइट के उपयोग में मतभेद का वर्णन है। इस उद्देश्य के लिए समर्पित सॉफ्टवेयर संकुल की संख्या बढ़ रही विभिन्न सांख्यिकीय मॉडल, प्रदर्शन और यूजर इंटरफेस 18 के आधार पर उपलब्ध हैं। इन के अलावा, मैट (ट्रांसक्रिप्ट splicing की बहुभिन्नरूपी विश्लेषण) एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध और सटीक कम्प्यूटेशनल एक Bayesian सांख्यिकीय ढांचे पर आधारित उपकरण के रूप में उभर रहे हैं और diffe पता लगाने के लिए डिज़ाइन किया गयाया तो एक या बनती अंत शाही सेना seq डेटा से rential splicing घटनाओं। गठबंधन (.bam) फ़ाइलों से शुरू, मैट वैकल्पिक splicing घटनाओं के सभी प्रमुख प्रकार का पता लगाने कर सकते हैं (एक्सॉन लंघन, वैकल्पिक 3 'ब्याह साइट, वैकल्पिक 5' ब्याह साइट, परस्पर अनन्य एक्सॉनों और Intron प्रतिधारण – भी चित्रा 1 देखें)।
पहला, सॉफ्टवेयर को दिखाता है जो एक निश्चित ब्याह घटना का समर्थन है, उदाहरण के एक्सॉन लंघन के लिए पढ़ता है, और उन्हें दो प्रकार में वर्गीकृत किया। "समावेशन पढ़ता है" (विहित ब्याह के आयोजन के लिए) की जांच की एक्सॉन के भीतर नक्शे और कहा कि विशिष्ट एक्सॉन और दो अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम flanking एक्सॉनों के बीच जंक्शनों अवधि। "लंघन पढ़ता है" (वैकल्पिक ब्याह के आयोजन के लिए) दो flanking एक्सॉनों के बीच जंक्शन अवधि। इसके बाद मैट दोनों विहित और वैकल्पिक घटनाओं के लिए सामान्यीकृत शामिल किए जाने के स्तर देता है और नमूने या स्थितियों के बीच मूल्यों तुलना करती है। अंत में, यह गणना पी-मूल्य एकएन डी झूठे खोज दर (एफडीआर) यह सोचते हैं कि दो स्थितियों के बीच एक जीन के संस्करण अनुपात में अंतर प्रत्येक splicing घटना 19,34 के लिए एक दिया उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित सीमा से अधिक है।
शाही सेना seq के साथ संयोजन के रूप में अंतर splicing विश्लेषण के बाद, एक व्यापक प्रायोगिक सत्यापन के क्रम में सच पॉजिटिव जीन उम्मीदवारों में 18 की पहचान करने में warranted है। मात्रात्मक रिवर्स लिखित-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (QRT- पीसीआर) शाही सेना Seq विश्लेषण 20 से प्राप्त उम्मीदवारों के सत्यापन में सबसे अधिक इस्तेमाल किया और इष्टतम तरीका है। इस पेपर का उद्देश्य ठोस ट्यूमर और कैंसर hematological में दवा प्रतिरोध संबंधी splicing प्रोफाइल की जांच करने के लिए एक मजबूत कार्यप्रणाली प्रदान करना है। हमारा दृष्टिकोण दवा प्रतिरोध में फंसा उम्मीदवार जीन की मान्यता के लिए एक स्थापित QRT- पीसीआर विधि के साथ संयोजन में दवा प्रतिरोधी कैंसर के चयनित कक्ष लाइन मॉडल की शाही सेना seq आधारित transcriptome की रूपरेखा का इस्तेमाल करता है।
<p clasएस = "jove_content"> मानव ल्यूकेमिया सेल लाइन इस अध्ययन में इस्तेमाल मॉडल शामिल बाल चिकित्सा टी सेल तीव्र लिम्फोब्लासटिक ल्यूकेमिया (टी सभी) सेल लाइन CCRF-यूके (यूके-WT), उसके दो glucocorticoid (जीसी) प्रतिरोधी subclones CEM -C7H2-R5C3 (यूके-सी 3) और यूके-C7R5 (यूके-R5) 21,22 और methotrexate (MTX) प्रतिरोधी SUBLINE यूके / R30dm 23। हालांकि वर्तमान जेंटलमैन कैडेट और MTX पर आधारित चिकित्सा मामलों के 90% के बारे में नैदानिक लाभ की स्थापना, जीसी प्रतिरोध के उद्भव अभी भी एक अस्पष्ट आणविक तंत्र के साथ एक अनसुलझी समस्या का प्रतिनिधित्व करता है। जीसी प्रतिरोधी उप क्लोन को अलग-थलग करने के लिए, यूके-WT कोशिकाओं को 2 से 3 सप्ताह के लिए 1 माइक्रोन dexamethasone (डेक्स) में सुसंस्कृत थे। MTX-प्रतिरोधी SUBLINE यूके / R30dm दोहराया लघु अवधि (24 घंटे) नैदानिक प्रोटोकॉल की एक नकल के रूप में 30 माइक्रोन के MTX को यूके-WT कोशिकाओं के संपर्क के माध्यम से विकसित किया गया था। दिलचस्प है, यह सेल लाइन भी है जिसके लिए तंत्र पूरी तरह से समझ नहीं है (अप्रकाशित परिणाम) डेक्स को पार प्रतिरोध का प्रदर्शन किया।ठोस Tumया मॉडल वर्तमान अध्ययन में जांच अग्नाशय नलीपरक ग्रंथिकर्कटता, रसायन चिकित्सा के लिए अपनी असाधारण दुराग्रह के लिए कुख्यात है। यह अंत करने के लिए, हम Panc-1 सेल लाइन और उसके Gemcitabine प्रतिरोधी उप क्लोन Panc-1R दवा 24 से 1 माइक्रोन के साथ निरंतर ऊष्मायन द्वारा प्राप्त का चयन किया। यहाँ हम तीन प्रोटोकॉल के संयोजन से इन विट्रो दवा प्रतिरोध अंतर्निहित उपन्यास तंत्र की खोज के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन: वर्णमिति cytotoxicity assays leukemic कोशिकाओं और ठोस ट्यूमर, शाही सेना seq आधारित पाइपलाइन से कैंसर की कोशिकाओं में दवा संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए संबंधित उपन्यास ब्याह वेरिएंट की पहचान करने के लिए दवा संवेदनशीलता / प्रतिरोध और आरटी पीसीआर और QRT- पीसीआर विश्लेषण संभावित उम्मीदवारों को मान्य।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ हम एक उपन्यास दृष्टिकोण है कि अच्छी तरह से स्थापित cytotoxicity स्क्रीनिंग तकनीक और शक्तिशाली NGS आधारित transcriptomic दवा प्रतिरोध के संबंध में अंतर splicing घटनाओं की पहचान करने के लिए विश्लेषण को जोड़ती है का वर्णन ह…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge prof. J.J. McGuire, prof. R. Kofler and dr. K. Quint for providing the resistant cell lines used in this work. The study has been founded by grants from Cancer Center Amsterdam (CCA) Foundation (to JC, EG and RS), the KiKa (Children Cancer-free grant for AW) foundation, the Law Offices of Peter G. Angelos Grant from the Mesothelioma Applied Research Foundation (to VEG and EG), Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC), Istituto Toscano Tumori (ITT), and Regione Toscana Bando FAS Salute (to EG).
Materials
| Sulforhodamine B | Sigma-Aldrich | 230162 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 251399 | |
| CCRF-CEM | ATCC, Manassas, VA, USA | ATCC CCL-119 | |
| Panc-1 | ATCC, Manassas, VA, USA | ATCC CRL-1469 | |
| DMEM high glucose | Lonza, Basel, Switzerland | 12-604F | |
| RPMI-1640 | Gibco, Carlsbad, CA, USA | 11875093 | |
| Fetal bovine and calf serum | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 758093 | |
| penicillin G streptomycin sulphate | Gibco, Carlsbad, CA, USA | 15140122 | |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Sigma Aldrich | 252859 | |
| MTT formazan | Sigma Aldrich | M2003 | |
| Anthos-Elisa-reader 2001 | Labtec, Heerhugowaard, Netherlands | UV-Vis 96-well plate spectrophotometer | |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Greiner/Sigma | M0812-100EA | |
| Trypsin/EDTA Solution 100 ml | Lonza, Basel, Switzerland | CC-5012 | |
| CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2 | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 82051-074 | |
| CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3 | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 82050-856 | |
| Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%) | B.Braun Melsungen AG, Germany | 362 3140 |
References
- Gottesman, M. M. Mechanisms of cancer drug resistance. Annu Rev Med. 53, 615-627 (2002).
- McDermott, M., et al. In vitro Development of Chemotherapy and Targeted Therapy Drug-Resistant Cancer Cell Lines: A Practical Guide with Case Studies. Front Oncol. 4, 40 (2014).
- Kaspers, G. J., et al. Prednisolone resistance in childhood acute lymphoblastic leukemia: vitro-vivo correlations and cross-resistance to other drugs. Blood. (1), 259-266 (1998).
- van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: the MTT assay. Methods Mol Biol. 731, 237-245 (2011).
- Vichai, V., Kirtikara, K. Sulforhodamine B colorimetric assay for cytotoxicity screening. Nat Protoc. 1 (3), 1112-1116 (2006).
- Wojtuszkiewicz, A., Assaraf, Y. G., Maas, M. J., Kaspers, G. J., Jansen, G., Cloos, J. Pre-mRNA splicing in cancer: the relevance in oncogenesis, treatment and drug resistance. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 673-689 (2015).
- Liu, S., Cheng, C. Alternative RNA splicing and cancer. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (5), 547-566 (2013).
- Wojtuszkiewicz, A., et al. Folylpolyglutamate synthetase splicing alterations in acute lymphoblastic leukemia are provoked by methotrexate and other chemotherapeutics and mediate chemoresistance. Int J Cancer. 138 (7), 1645-1656 (2016).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 10, 1135-1145 (2008).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 1, 57-63 (2009).
- Ozsolak, F., Milos, P. M. RNA sequencing: advances, challenges and opportunities. Nat Rev Genet. 2, 87-98 (2011).
- Han, Y., Gao, S., Muegge, K., Zhang, W., Zhou, B. Advanced Applications of RNA Sequencing and Challenges. Bioinform Biol Insights. 9 (Suppl 1), 29-46 (2015).
- Khatoon, Z., Figler, B., Zhang, H., Cheng, F. Introduction to RNA-Seq and its applications to drug discovery and development. Drug Dev Res. 5, 324-330 (2014).
- Zhao, S., et al. Comparison of stranded and non-stranded RNAseq transcriptome profiling and investigation of gene overlap. BMC Genomics. 16, 675 (2015).
- Carrara, M., et al. Alternative splicing detection workflow needs a careful combination of sample prep and bioinformatics analysis. BMC Bioinformatics. 16 (Suppl 9), (2015).
- Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).
- Wang, L., Wang, S., Li, W. RSeQC: quality control of RNA-seq experiments. Bioinformatics. 28, 2184-2185 (2012).
- Hooper, J. E. A survey of software for genome-wide discovery of differential splicing in RNA-Seq data. Hum Genomics. 8, (2014).
- Shen, S., et al. MATS: a Bayesian framework for flexible detection of differential alternative splicing from RNA-Seq data. Nucleic Acids Res. 8, e61 (2012).
- Vargas, I. M., Vivas-Mejìa, P. E. Assessment of mRNA splice variants by qRT-PCR. Methods Mol Biol. 1049, 171-186 (2013).
- Hala, M., Hartmann, B. L., Böck, G., Geley, S., Kofler, R. Glucocorticoid-receptor-gene defects and resistance to glucocorticoid-induced apoptosis in human leukemic cell lines. Int J Cancer. 68 (5), 663-668 (1996).
- Schmidt, S., et al. Glucocorticoid resistance in two key models of acute lymphoblastic leukemia occurs at the level of theglucocorticoid receptor. FASEB J. 20 (14), 2600-2602 (2006).
- McCloskey, D. E., McGuire, J. J., Russell, C. A., Rowan, B. G., Bertino, J. R., Giuseppe Pizzorno, G., et al. Decreased folylpolyglutamate synthetase activity as a mechanism of methotrexate resistance in CCRF-CEM human leukemia sublines. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6181-6187 (1991).
- Quint, K., et al. Pancreatic cancer cells surviving gemcitabine treatment express markers of stem cell differentiation and epithelial-mesenchymal transition. Int J Oncol. 41 (6), 2093-2102 (2012).
- Lin, S., et al. DDX5 is a positive regulator of oncogenic NOTCH1 signaling in T cell acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 32 (40), 4845-4853 (2013).
- Mazurek, A., et al. Acquired dependence of acute myeloid leukemia on the DEAD-box RNA helicase DDX5. Cell Rep. 7 (6), 1887-1899 (2014).
- Calabretta, S., et al. Modulation of PKM alternative splicing by PTBP1 promotes gemcitabine resistance in pancreatic cancer cells. Oncogene. , (2016).
- Azoitei, N., et al. PKM2 promotes tumor angiogenesis by regulating HIF-1α through NF-κB activation. Mol Cancer. 15 (1), (2016).
- Samuels, A. L., Heng, J. Y., Beesley, A. H., Kees, U. R. Bioenergetic modulation overcomes glucocorticoid resistance in T-lineage acute lymphoblastic leukaemia. Br J Haematol. 165 (1), 57-66 (2014).
- Rots, M. G., Pieters, R., Kaspers, G. J., Veerman, A. J., Peters, G. J., Jansen, G. Classification of ex vivo methotrexate resistance in acute lymphoblastic and myeloid leukaemia. Br J Haematol. 110 (4), 791-800 (2000).
- Funel, N., et al. Laser microdissection and primary cell cultures improve pharmacogenetic analysis in pancreatic adenocarcinoma. Lab Invest. 88 (7), 773-784 (2008).
- Gillet, J. P., et al. Redefining the relevance of established cancer cell lines to the study of mechanisms of clinical anti-cancer drug resistance. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18708-18713 (2011).
- Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nat Rev Drug Discov. 11 (2), 125-140 (2012).
- Shen, S., et al. rMATS: robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), E5593-E5601 (2014).
