超极化¹³ç代谢磁共振波谱与成像

Summary

Dynamic nuclear polarization with subsequent sample dissolution has enabled real-time studies of metabolism in biological systems. Hyperpolarized [1-¹³C]pyruvate was used to study lactate dehydrogenase activity in a prostate carcinoma cell line in vitro.

Abstract

在过去的几十年里，肿瘤分期，再分期，治疗反应的监测，以及多种癌症复发的检测新方法已经出现连同¹⁸架F-氟^（[18 F在国家的最先进的正电子发射断层扫描] -FDG PET）。 ¹³ C核磁共振光谱成像^（13 CMRSI）是一种微创成像方法，能够代谢的体内和实时监控。作为与基于¹³ C核磁共振（NMR）的任何其他方法，它面临低热极化和随后的低信噪比的挑战，因为在^13℃和其低天然丰度的相对低的旋磁比生物样品。通过克服这些限制，动态核极化（DNP）与随后的样品溶解最近启用常用NMR和磁共振成像（MRI）系统来测量在各种生物系统的研究中，以及图像关键代谢途径。在¹³ CMRSI使用一个特别有趣的和有希望的分子是[1- ¹³ C]丙酮酸盐，其中，在过去的十年里，已被广泛用于体外 ，临床前，以及最近，临床研究调查细胞的能量代谢在癌症和其他疾病。在这篇文章中，我们使用的是3.35牛逼临床DNP超极化勾勒溶解DNP的技术，并展示在体外研究它的用法。类似的协议为超极化可以适用于在体内研究的大部分为好。要做到这一点，我们使用乳酸脱氢酶（LDH）和催化[1- ¹³ C]丙酮酸使用¹³ CMRSI [1- ¹³ C]乳酸盐在前列腺癌细胞系，PC3， 体外代谢反应。

Introduction

目前，为肿瘤分期，再分期，治疗反应监测，复发的检测多种癌症的最广泛使用的临床方法是^[18 F] -FDG的PET。 ^[1]然而，最近，一些新颖的方式和其他方式已经出现。其中的一个方法是¹³ CMRSI。该技术包括引入¹³ C-分子成的生物样品，接着微创MRI评估在体外或在实时体内的代谢。尽管如此^，13 CMRSI的最大的挑战，相对于其他方法，如^[18 F] -FDG的PET或计算机断层扫描，是它的低信噪比。

NMR信号成正比偏振在两个能态的自旋1/2核人口差与总人口的比例（ 图1A）的水平。偏振是第一个产品细胞核电子旋磁比（γ）和在温度所施加的磁场强度。的¹ H核的典型极化是在0.001％至0.005％的顺序在3 T，它给出了一个相对较差的信噪比。今天的国家的最先进的MRI是一个成功的成像方法，不仅是因为高丰¹小时生物样品中和¹小时的高旋磁比（γ= _1H兆赫42.576 / T）。然而，观察其他核，如碳，更苛刻。唯一稳定的，磁活性碳同位素^，13℃，只占1.1％的所有碳原子。此外_{^{，13℃（γ13C}} = 10.705兆赫/ T）的旋磁比大于¹小时的低四倍，从而导致更低的检测效率。总之，低¹³ C丰度和低_γ13C引起热¹³ C测量来实现的一个¹的灵敏度的0.0176％H-NMR测定体内 。

动态核极化

克服¹³ C测量相对较差的灵敏度的方法是DNP。它是由阿尔伯特·W·欧沃豪斯对金属的最初描述于1953年。在他的文章中，他指出：“这表明，如果传导电子的电子自旋共振是饱和的，细胞核将被极化，以相同的程度，如果他们的旋磁比为使电子自旋的，他们将是^”2后来那年，卡弗和Slichter实验证实的Overhauser的假设^3。 1958年，Abragam和宝洁描述了这种效应在液体电子和它命名为“坚实的效果。”在温度低于4 K，电子自旋极化达到近100％，是大小比核自旋极化（ 图^1B）4更高的超过三个数量级。 ŧ发生了由于电子的旋磁比_（γE = 28024.944兆赫/ T）为大小比核旋磁比更高的三个数量级。电子和原子核，如Overhauser效应，固体效果，交叉效果，热混合效果之间的弱相互作用，允许极化的传递使用微波照射以频率靠近相应的电子从电子自旋核自旋顺磁共振（EPR）频率^5,6。 DNP理论得到了进一步发展涉及到更多的电子和热混合。然而，迄今为止，DNP的不统一的量化理论描述已发表^7,8。

图1：了解动态核极化和超极化。 A）自旋人口的示意图对比在热平衡偏振状态和超极化的状态。 B）中的偏振取决于温度。 （E ^{– ）}的电子的极化达到低于1.4 K的DNP 100％允许偏振从电子到¹³ C核，这增加了它们的偏振高达10 ⁵倍的转移。 请点击此处查看该图的放大版本。

在使用¹³ C-NMR生物系统的研究介绍DNP，随后快速样品溶解已被开发。 50年代以后的Overhauser的假设，扬H. Ardenkjaer拉森等人。解决使超极化冷冻样品到液体状态以最小的超极化损失⁶的技术上具有挑战性的问题。解散DNP打开一个新的研究领域被称为¹³ CMRS我，提供了新的方法来研究和描述各种疾病状态^9,10。不成对电子，三苯甲基自由基三（8-羧基-2,2,6,6-四（羟基乙基）-benzo- [1,2-4,5] – 双 – （1,3），作为稳定的载体-dithiole -4-基）盐 – 甲基钠（OX063）或（2,2,6,6-四甲基哌啶-1-基）氧基（TEMPO）通常被使用。这些都与期望的¹³ C标记的分子混合并暴露于微波辐射与接近相应的EPR频率的频率。使用这种技术的¹³ C核的极化可以增加高达^37％11。这导致了10 ⁵倍极化增强相比，热平衡极化^11,12。然而，只要在微波辐射停止和/或¹³ C-分子转移到液体状态，极化与已偏振的¹³ C核的纵向弛豫时间（T _1）衰减。因此，该快速溶解技术发明或任何后续技术缩短实验测量（ 即注射）之前是生物应用¹³关键的时间。

有迹象表明，候选分子需要满足成功¹³ CMRSI研究三大要求。第一，所关心的¹³ C核必须具有足够长的T _1（> 10秒）。的¹³ C-标签的选择是至关重要的。最佳候选细胞核碳经由键用¹ H-细胞核没有直接接触。它也需要在2被迅速代谢- 3个T ₁次，导致下游代谢产物与从原始物质的显著不同的化学位移。样品混合物还必须形成无定形固体状态时玻璃，使得空间分布减小电子和¹³ C之间的距离，从而使反两极分化的外汇储备。如果候选分子不自然地形成非晶化玻璃，它需要在装配玻璃剂高度可溶的，如甘油或二甲基亚砜^14。这些要求导致相对小数目的候选分子。然而，即使是合适的分子的成功发现后，开发工作的协议为超极化可以是技术上具有挑战性^9,14,15。

近年来，一些衬底已成功偏振光，如[1- ¹³ C]丙酮酸^{12,16 – 36，[2- 13} C]丙酮酸^{37，[1- 13} C]丙酮酸乙酯^{38，[1- 13} C ]乳酸^{39，[1- 13} C]富马酸^{40 – 43，13} C-碳酸氢盐^{36,44,45，[1- 13} C]乙酸钠^{43,46 – 49，13} C尿素^6,36,50,51 ，[5- ¹³ C] glutamiNE ^{15,52,53，[1- 13} C]谷氨酸^{53,54，[1- 13} C] 2-酮戊二酸^{55，[1- 13} C]丙氨酸，和其他人^14,56。对于超极化一个特别有趣的和常用的基材是[1- ¹³ C]丙酮酸盐。它被广泛用于临床前研究以调查在各种疾病^14,17,22细胞能量代谢。 [1- ¹³ C]丙酮酸满足所有成功超极化的要求，包括随后被代谢前穿过细胞膜相对长T ₁和快速运输。用[1- ¹³ C]丙酮酸临床前研究，目前正在翻译成诊所^57。

丙酮酸代谢

众所周知，有一种癌细胞的DNA，并在其代谢途径变化突变之间的直接联系。早在20世纪20年代，奥托华宝discovERED有葡萄糖和生产乳酸的肿瘤中增加的代谢相比健康组织^{58 – 60。}接着，在其他代谢途径，如戊糖磷酸途径，三羧酸循环，氧化磷酸化，和核苷酸和脂类的合成各种替换，已经描述。

丙酮酸是糖酵解的终产物。在肿瘤，它经历由乳酸脱氢酶⁶¹催化的无氧酵解和与辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原形式反应 （NADH），产生乳酸和辅酶（NAD ^+）的氧化形式。可替代地，丙酮酸经过与谷氨酸以形成丙氨酸氨基转移反应，由丙氨酸转氨酶（ALT）的催化。这两种反应是可逆的。丙酮酸也经历脱羧通过丙酮酸脱氢酶（PDH）催化二氧化碳和乙酰-CoA河epresenting在该步骤的不可逆反应。在这些反应速率还可以对与肿瘤代谢^{17,21,22,25,62。}代谢途径总结于图2。

图2：丙酮酸的主要代谢反应的示意图。丙酮酸/乳酸盐转化是通过LDH催化，和丙酮酸/丙氨酸转化是通过ALT催化。丙酮酸不可逆地转化为乙酰-CoA和CO ₂通过PDH，和CO ₂与碳酸氢盐⁸⁰ pH依赖平衡。 请点击此处查看该图的放大版本。

超极化[1- ¹³ C]丙酮酸及其代谢物的检测已经在大鼠先前证实他本领域^{37,63 – 65，}肝脏^66，肌肉和肾^62,67。一项研究证明了在正常和禁食大鼠肝⁶⁶之间的乳酸对丙氨酸的比例显著差异，表现在肝癌^68,69高度升高和超极化[1- ¹³ C]乳酸水平。有证据表明，肿瘤分级可以在使用超极化[1- ¹³ C]丙酮酸²²小鼠前列腺（TRAMP）的转基因腺癌被识别，与超极化乳酸水平表示与切除的肿瘤的组织学分级的高相关性。由ALT从丙酮酸催化丙氨酸也被建议作为大鼠肝癌²³的有用标志物。

测量丙酮酸乳酸代谢通量已用于监测缺血^63,65,70和与细胞毒性化疗^17,40，靶向药物对治疗的响应<SUP> 24,25,41，或在动物模型中放疗^26。它也被用于检测在成胶质细胞瘤和乳腺癌的小鼠模型²⁵中的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抑制剂LY294002反应。在脑丙酮酸代谢的变化肿瘤²⁶和前列腺癌^24,71也被治疗后观察到的。

前列腺癌

前列腺癌是男性死亡相关的全球⁷²老年男性和的第二大癌症的主要癌症。迄今为止，还没有可靠的，非侵入性的方法可用于前列腺癌^73,74的早期诊断和表征，强调新颖代谢成像技术，迫切需要使严格的检测和患者分期。前列腺癌被用作模型以证明溶解的DNP ¹³ CMRSI在患者合并的可能性第^57条 。这项工作是继续在第一期临床试验采用[1- ¹³ C]丙酮酸和¹³ CMRSI为前列腺癌的成像和它最近刚刚已经完成（NCT01229618）。

这背后的工作的动机是更详细和更广泛的受众¹³ CMRSI方法与细胞的临床前设置应用程序来说明。测定[1- ¹³ C]丙酮酸LDH催化代谢[1- ¹³ C]乳酸盐在 PC3前列腺癌细胞系的体外 ，我们表明溶解的DNP在体外研究的可能的应用和处理的关键步骤和在实验过程中的挑战。

Protocol

1.样品原液制备 gadoterate葡甲胺（GadM，0.5摩尔/升）加入到浓缩的[1- 13 C]丙酮酸得到1-毫摩尔/升GadM的终浓度。添加三苯甲基自由基三（8-羧基-2,2,6,6-四（羟基乙基）-benzo- [1,2-4,5] – 双 – （1,3）-dithiole -4-基） – 盐甲基钠（OX063）到该混合物中，得到15毫摩尔/ L的终浓度。涡旋直至完全溶解。 注意：此储备溶液制备被设计用于与3.35-T临床前的DNP超极化的使用。当使用7-T临床超极化，…

Representative Results

的“微波扫描”的结果在图3中示出。它表明，对于[1- 13 C]丙酮酸样品的最佳微波频率为94.156千兆赫的本地3.35-T的超极化。以下所有超极化实验（N = 14）用100毫瓦的功率这种微波频率进行。微波辐射被施加60至80分钟，导致固态超极化高于90％。结果列于图4中。超极化[13℃]的丙酮酸，用5×10 6（N = 2），10 7（N = 2），2×10 7（N = 1），3?…

Discussion

¹³ CMRSI与超极化探针是实时监测代谢的体外 和体内有前途的方法。其中很重要的一个方面，当使用这种实验过程是适当的标准化，体外实验特别是有关。首先，需要正确地和一致地完成，以实现每个实验超极化材料的相同浓度试样的制备。这需要一个精确称重两种样品是超极化和缓冲。如果浓度是不正确的，该溶液的最终pH是不准确的，它可以有对T ₁的细胞的…

Materials

HyperSense DNP Polariser	Oxford Instruments		3.35 T preclinical DNP hyperpolarizer
GE/Agilent MR901	GE Healthcare/Agilent Technologies		7 T preclinical MRI scanner, with small bore designed for experiments onrodent
Spinsolve Carbon	Magritek		1 T NMR spectrometer with permanent magnet
Deuterium Oxide	Sigma Aldrich	7789-20-0
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	7558-79-4
Sodium phosphate monbasic	Sigma Aldrich	7558-80-7
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	1310-73-2
Disodium edetate	Sigma Aldrich	6381-92-6
Pyruvic acid – 13C1	Cambridge Isotopes Laboratories	CLM-8077-1
Dotarem (0.5 mmol/L)	Guerbet		gadoterate meglumine
tris (8-carboxy-2,2,6,6-tetra-(hydroxyethyl)-benzo-[1,2–4,5]-bis-(1,3)-dithiole-4-yl)-methyl sodium salt (OX063)	GE Healthcare		trityl radical used as a sourse of free electron
PC3 cell line	ATCC	CRL1435
F-12K medium	ATCC	30-2004
Fetal Bovine Serum	ATCC	SCRR-30-2020
Trypsine-EDTA Solution, 1X	ATCC	30-2101
Sample plastic cup	Oxford Instruments
Trypan blue	Bio-Rad	145-0013-MSDS