hyperpolarisiertem¹³ C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging

Summary

Dynamic nuclear polarization with subsequent sample dissolution has enabled real-time studies of metabolism in biological systems. Hyperpolarized [1-¹³C]pyruvate was used to study lactate dehydrogenase activity in a prostate carcinoma cell line in vitro.

Abstract

In den vergangenen Jahrzehnten wurden neue Methoden zur Tumor – Staging, Restaging, Ansprechen auf die Behandlung Überwachung, und ein erneutes Auftreten Nachweis einer Vielzahl von Krebserkrankungen haben in Verbindung mit dem state-of-the-art – Positronen – Emissions – Tomographie mit ¹⁸ F-fluorodeoxyglucose ^([18 F entstanden ] -FDG PET). ¹³ C – Magnetresonanz – spektroskopischen Bildgebung ⁽¹³ CMRSI) ist eine minimal invasive Bildgebungsverfahren, das die Überwachung des Stoffwechsels in vivo und in Echtzeit ermöglicht. Wie bei jedem anderen Verfahren , basierend auf ¹³ C kernmagnetische Resonanz (NMR), steht sie vor der Herausforderung mit niedriger thermischer Polarisation und einer anschließenden geringen Signal-zu-Rausch – Verhältnis aufgrund des relativ niedrigen gyromagnetische Verhältnis von ¹³ C und seiner geringen natürlichen Häufigkeit in biologischen Proben. Durch Überwindung hat diese Beschränkungen, dynamische Kernpolarisation (DNP) mit anschließender Probenauflösungs kürzlich häufig verwendeten NMR und Kernspintomographie (MRI) -Systeme zur Messung aktiviert, Studium und Bild Schlüssel Stoffwechselwege in verschiedenen biologischen Systemen. Ein besonders interessantes und vielversprechendes Molekül in ¹³ CMRSI verwendete [1- ¹³ C] Pyruvat, die in den letzten zehn Jahren wurde für in vitro, preclinical weithin verwendet worden, und in jüngster Zeit , klinische Studien der zellulären Energiestoffwechsels zu untersuchen bei Krebs und anderen Krankheiten. In diesem Artikel erläutern wir die Technik der Auflösung DNP unter Verwendung eines 3,35 T präklinische DNP Hyperpolarisierer und zeigen seine Verwendung in In – vitro – Studien. Ein ähnliches Protokoll für die Hyperpolarisation kann auch zum größten Teil in in – vivo – Untersuchungen angewendet werden. Dazu verwendeten wir Lactat – Dehydrogenase (LDH) und katalysiert die metabolische Reaktion von [1- ¹³ C] Pyruvat [1- ¹³ C] Lactat in einer Prostatakarzinomzelllinie PC3, in vitro unter Verwendung von ¹³ CMRSI.

Introduction

Gegenwärtig ist die am weitesten verbreitete klinische Methode für Tumor – Staging, Restaging, Ansprechen auf die Behandlung Überwachung und Rezidiverkennung von einer Vielzahl von Krebserkrankungen ^[18 F] -FDG PET. ¹ jedoch in jüngster Zeit mehrere neue und alternative Ansätze entstanden. Eine dieser Methoden ist ¹³ CMRSI. Diese Technik beinhaltet die Einführung des ¹³ C-Moleküls in einer biologischen Probe, durch minimal invasive MRI folgte dem Stoffwechsel in vitro oder in vivo in Echtzeit zu bewerten. Dennoch ist die größte Herausforderung von ¹³ CMRSI, im Vergleich zu den anderen Verfahren, wie ^[18 F] -FDG PET oder Computertomographie, ist seine niedrige Signal-zu-Rausch – Verhältnis.

Das NMR – Signal ist direkt proportional zu der Ebene der Polarisation, ein Verhältnis der Spin ½ Keimpopulation Differenz in zwei Energiezustände an der Gesamtbevölkerung (1A). Die Polarisation ist ein Produkt der the gyromagnetische Verhältnis (γ) der Kerne und das Magnetfeld angelegt Festigkeit über der Temperatur. Eine typische Polarisations von ¹ H – Kerne ist in der Größenordnung von 0,001% bis 0,005% bei 3 T, das ein relativ schlechtes Signal-Rausch – Verhältnis ergibt. Heutigen state-of-the-art MRI hat nur eine erfolgreiche Bildgebungsverfahren gewesen aufgrund der hohen Fülle von ¹ H in biologischen Proben und der hohen gyromagnetischen Verhältnis von ¹ H (& gamma; _1H = 42,576 MHz / T). Jedoch beobachtet andere Kerne, wie beispielsweise Kohlenstoff, ist anspruchsvoller. Der einzige stabile, magnetisch aktiven Kohlenstoffisotops ¹³ C, macht nur 1,1% aller Kohlenstoffatome. Darüber hinaus ist die gyromagnetische Verhältnis von ¹³ C (γ _13C = 10,705 MHz / T) ist viermal geringer als die von ¹ H, zu einer niedrigeren Nachweiseffizienz führt. Insgesamt verursachen die niedrigen ¹³ C Fülle und niedrige γ _13C Wärme ¹³ C – Messungen 0,0176% der Empfindlichkeit eines ¹ zu erreichen ,H-NMR – Messung in vivo.

Dynamische Kernpolarisation

Eine Methode , um die relativ geringe Empfindlichkeit von ¹³ C – Messungen zu überwinden , ist DNP. Es wurde ursprünglich im Jahre 1953 von Albert W. Overhauser- für Metalle beschrieben. In seinem Artikel, er sagte: "Es wird gezeigt , dass , wenn die Elektronenspinresonanz der Leitungselektronen gesättigt ist, werden die Kerne in gleichem Maße polarisiert werden sie , wenn ihr gyromagnetische Verhältnis , dass waren der Elektronenspin sein würde." ² Später in diesem Jahr, Carver und Slichter experimentell bestätigt Overhauser- Hypothese ^3. Im Jahr 1958 beschrieben Abragam und Proctor diesen Effekt für Elektronen in Flüssigkeiten und nannte sie die "solid-Effekt." Bei Temperaturen unterhalb von 4 K, Elektronenspinpolarisation erreicht fast 100% und mehr als drei Grßenordnungen höher als die Kernspinpolarisation (1B) ^4. Tseine tritt auf, weil das gyromagnetische Verhältnis des Elektrons (γ _e = 28.024,944 MHz / T) um drei Größenordnungen höher ist als die Kern gyromagnetischen Verhältnisse. Die schwachen Wechselwirkungen zwischen Elektronen und Kernen, wie beispielsweise die Overhauser-Effekt, der festen Wirkung, den Quereffekt und der thermischen Mischwirkung ermöglichen die Übertragung der Polarisation von Elektronen an Kernspins dreht unter Verwendung von Mikrowellenbestrahlung mit einer Frequenz nahe der entsprechenden Elektronen Spinresonanz (EPR) Frequenz ^5,6. DNP Theorie wurde weiterentwickelt mehr Elektronen und thermische Vermischung einzubeziehen. Trotzdem bisher wurde ^7,8 veröffentlicht keine einheitliche quantitative theoretische Beschreibung von DNP.

Abbildung 1: Dynamische Kernpolarisation und Hyperpolarisation zu verstehen. A) Ein schematischer Vergleich der Spinpopulationim thermischen Gleichgewicht Polarisationszustand und dem hyperpolarisierten Zustand. B) Die Polarisation ist abhängig von der Temperatur. Die Polarisation eines Elektrons (e ^-) erreicht 100% unter 1,4 K. Die DNP ermöglicht den Transfer der Polarisation von dem e- an die ¹³ C – Kerne, die bis zu 10 ⁵ -fache ihrer Polarisation erhöht. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

DNP in Studien von biologischen Systemen Auflösung entwickelt hatte , werden unter Verwendung von ¹³ C – NMR, anschließende schnelle Probe einzuführen. 50 Jahre nach Overhauser- Hypothese, Jan H. Ardenkjaer-Larsen et al. löste das technisch anspruchsvolle Ausgabe ⁶ das hyperpolarisierte gefrorene Probe in den flüssigen Zustand mit einem minimalen Verlust von Hyperpolarisation zu bringen. Die Auflösung DNP eröffnet ein neues Forschungsgebiet ¹³ CMRS genanntI, die Bereitstellung eines neuen Verfahrens zu untersuchen und zu verschiedenen Krankheitszuständen ^9,10 charakterisieren. Als stabile Träger eines ungepaarten Elektrons, ein Tritylrest Tris (8-carboxy-2,2,6,6-tetra (hydroxyethyl) -benzo- [1,2-4,5] -bis- (1,3) -dithiole-4-yl) methyl-Natriumsalz (OX063) oder (2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-yl) oxyl (TEMPO) wird üblicherweise verwendet. Diese werden mit der gewünschten ¹³ C-markiertes Molekül vermischt und ausgesetzt einer Mikrowellenbestrahlung mit einer Frequenz nahe der entsprechenden EPR – Frequenz. Unter Verwendung dieser Technik kann die Polarisation von ¹³ C – Kerne erhöht werden bis zu 37% ^11. Dies führt zu einem 10 ⁵ -fachen Polarisations Verbesserung gegenüber dem thermischen Gleichgewicht Polarisations ^11,12. Jedoch, sobald die Mikrowellenbestrahlung gestoppt wird und / oder dem ¹³ C-Molekül in den flüssigen Zustand überführt wird, fällt die Polarisations mit der longitudinalen Relaxationszeit (T ₁₎ des ¹³ C – Kern , die polarisiert wurde. Und so kam es dass derErfindung der schnellen Auflösung Techniken oder jede nachfolgende Technik die Zeit vor dem experimentellen Messung Verkürzung (dh Injektion) für biologische Anwendungen ¹³ von entscheidender Bedeutung ist.

Es gibt drei wichtige Anforderungen , die das Kandidatenmolekül für eine erfolgreiche ¹³ CMRSI Studien erfüllen muss. Erstens hat der ¹³ C – Kern von Interesse eine ausreichend lange T ₁ haben (> 10 s). Die Wahl der ¹³ C-Markierung ist von entscheidender Bedeutung. Die besten Kandidaten Kerne sind Kohlenstoffe ohne direkten Kontakt mit ¹ H-Kerne über eine Bindung. Es muss auch schnell innerhalb von 2 metabolisiert werden – 3 T ₁ Mal in einem nachgeschalteten Stoffwechselprodukt entstehende mit deutlich unterschiedlichen chemischen Verschiebung von der ursprünglichen Substanz. Das Gemisch Probe muss auch ein amorphes Glas , wenn es in einem festen Zustand bilden , so daß die räumliche Verteilung des Abstandes zwischen dem Elektron und ¹³ C abnimmt, so dass die transfer der Polarisation. Wenn das Kandidatenmolekül natürlicherweise nicht amorphes Glas bilden, muss sie sehr gut löslich in einem Verglasungsmittel sein, wie Glycerin oder Dimethylsulfoxid ^14. Diese Anforderungen führen zu einer relativ geringen Anzahl von Kandidatenmolekülen. Aber auch nach dem erfolgreichen Entdeckung eines geeigneten Moleküls kann ein Arbeitsprotokoll für Hyperpolarisation der Entwicklung technisch anspruchs ^9,14,15.

Erfolgreich polarisiert, wie [1- ¹³ C] Pyruvat ^12,16 In den letzten Jahren wurden mehrere Substrate gewesen ^{– 36} [2- ¹³ C] Pyruvat – ^37, [1- ¹³ C] Ethylpyruvat ^38, [1- ¹³ C ] Lactat ^39, [1- ¹³ C] Fumarat ^{40-43, 13} C-Bicarbonat ^36,44,45, [1- ¹³ C] Natriumacetat ^{43,46 – 49, 13} C-Harnstoff – ^6,36,50,51 [5- ¹³ C] glutamine ^15,52,53, [1- ¹³ C] Glutamat ^53,54, [1- ¹³ C] 2-Oxoglutarat ^55, [1- ¹³ C] Alanin und andere ^14,56. Eine besonders interessante und häufig verwendete Substrat für die Hyperpolarisation ist [1- ¹³ C] Pyruvat. Es ist weit verbreitet in der präklinischen Studien ^14,17,22 der zellulären Energiestoffwechsel bei verschiedenen Erkrankungen zu untersuchen. [1- ¹³ C] Pyruvat erfüllt alle Anforderungen für eine erfolgreiche Hyperpolarisation, einschließlich einer relativ langen T ₁ und schnellen Transport über die Zellmembran , bevor anschließend metabolisiert wird. Präklinische Studien mit [1- ¹³ C] Pyruvat sind zur Zeit in der Klinik ⁵⁷ übersetzt.

Metabolismus von Pyruvat

Es ist bekannt, dass es eine direkte Verbindung zwischen Mutationen in einem Krebszellen DNA und Veränderungen in ihrer Stoffwechselwege ist. Bereits in den 1920er Jahren, Otto Warburg DiscovEred , dass es in Tumoren im Vergleich zu gesundem Gewebe ⁵⁸ einen erhöhten Stoffwechsel von Glukose und Produktion von Laktat ^{– 60.} Anschließend verschiedene Änderungen in anderen Stoffwechselwegen, wie dem Pentose-Phosphat-Weg, den Tricarbonsäurezyklus, oxidative Phosphorylierung und die Synthese von Nukleotiden und Lipiden, sind beschrieben worden.

Pyruvat ist das Endprodukt der Glykolyse. Im Tumor, erfährt er anaerobe Glycolyse von LDH katalysierte ⁶¹ und reagiert mit der reduzierten Form des Nicotinamid – adenin – dinucleotid – Coenzym (NADH), was zu Laktat und der oxidierten Form des Coenzyms (NAD ^+). Alternativ erfährt Pyruvat eine Transaminierung mit Glutamat Alanin zu bilden, durch die Alanin-Transaminase katalysierte (ALT). Beide Reaktionen sind leicht reversibel. Pyruvat erfährt auch Decarboxylierung von Pyruvat-Dehydrogenase katalysiert (PDH) zu Kohlendioxid und Acetyl-CoA, reine irreversible Reaktion in diesem Schritt epresenting. Abwechslungen in diesen Reaktionsraten können auf Tumormetabolismus ^{17,21,22,25,62} verknüpft werden. Die Stoffwechselwege sind in Figur 2 zusammengefasst.

Abbildung 2: Schematische Darstellung der wichtigsten Stoffwechselreaktion von Pyruvat. Pyruvat / Laktat-Umwandlung wird durch LDH katalysiert, und Pyruvat / Alanin Umwandlung wird durch ALT katalysiert. Pyruvat wird irreversibel an Acetyl-CoA und CO ₂ durch PDH umgewandelt und CO ₂ in einem pH-abhängigen Gleichgewicht mit Bicarbonat ^80. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Der Nachweis von hyperpolarisiertem [1- ¹³ C] Pyruvats und seiner Metaboliten wurde in der Ratte zuvor gezeigt erKunst ^{37,63 – 65,} Leber ^66, Muskel und Niere ^62,67. Eine Studie zeigte signifikante Unterschiede in der Lactat-zu-Alanin – Verhältnis zwischen der normalen und fasteten Rattenleber ⁶⁶ und zeigten eine stark erhöhte und hyperpolarisiertem [1- ¹³ C] Laktatspiegel in Leberkrebs ^68,69. Es gibt Anzeichen dafür , dass die Tumorgrad kann in einem transgenen Maus – Adenokarzinom der Prostata (TRAMP) unter Verwendung von hyperpolarisiertem [1- ¹³ C] Pyruvat – ^22, mit dem hyperpolarisierten Laktatspiegel zeigt , die eine hohe Korrelation mit dem histologischen Grad der herausgeschnittenen Tumoren identifiziert werden. Das Alanin aus Pyruvat durch ALT katalysiert wurde auch als ein nützlicher Marker in rat hepatozellulären Karzinoms ²³ vorgeschlagen.

Messung der Pyruvat-Lactat metabolischen Flusses wurde zur Überwachung Ischämie ^63,65,70 und als Reaktion auf die Behandlung mit einer zytotoxischen Chemotherapie ^17,40, zielgerichtete Medikamente verwendet <sup> 24,25,41 oder Strahlentherapie ²⁶ in Tiermodellen. Es wurde auch für den Nachweis der Phosphatidylinositol – 3-Kinase (PI3K) -Inhibitor LY294002 Reaktion in Glioblastom und Brustkrebs Mausmodellen ²⁵ verwendet. Veränderungen im Pyruvatstoffwechsels bei Hirntumoren ²⁶ und Prostatakrebs ^24,71 haben auch nach der Behandlung beobachtet.

Prostatakarzinom

Das Prostatakarzinom ist die vorherrschende Krebs bei älteren Männern und der zweite bei Männern weltweit ⁷² zum Tode im Zusammenhang mit führenden Krebs. Bisher wurden keine zuverlässigen, nicht-invasive Methoden zur Verfügung , für eine frühe Diagnose und Charakterisierung von Prostata – Krebs ^73,74, die dringende Notwendigkeit für neuartige metabolische Bildgebung Techniken betont strenge Erkennung und Durchführung von Patienten zu ermöglichen. Das Prostatakarzinom wurde als Modell verwendet , mit ¹³ CMRSI in Patienten kombiniert die Möglichkeiten der Auflösung DNP zu demonstrierens ^57. Diese Arbeit wurde in einer ersten klinischen Studie unter Verwendung fortgesetzt [1- ¹³ C] Pyruvat und ¹³ CMRSI für die Abbildung von Prostatakrebs, und es hat gerade abgeschlossen kürzlich (NCT01229618).

Die Motivation hinter dieser Arbeit war die Anwendung der ¹³ CMRSI Methode in einer präklinischen Einstellung mit Zellen im Detail und für ein breiteres Publikum zu illustrieren. Messung der LDH-katalysierten Metabolismus von [1- ¹³ C] Pyruvat [1- ¹³ C] Lactat in vitro in der PC3 Prostata – Karzinom – Zelllinie, zeigen wir die mögliche Anwendung der Auflösungs DNP in in vitro – Studien und adressieren die entscheidenden Schritte und Herausforderungen während der Experimente.

Protocol

1. Probenstammlösung Vorbereitung Hinzufügen gadoterate Meglumin (GADM, 0,5 mol / L) zu konzentrierter [1- 13 C] Brenztraubensäure mit einer Endkonzentration von 1 mmol / L GADM zu geben. Hinzufügen Tritylrest Tris (8-carboxy-2,2,6,6-tetra (hydroxyethyl) -benzo- [1,2-4,5] -bis- (1,3) -dithiole-4-yl) – methyl Natriumsalz (OX063) zu dieser Mischung zu einer Endkonzentration von 15 mmol / L zu ergeben. Vortex bis zur vollständigen Auflösung. HINWEIS: Diese Stammlösung Vorbereitung ist f?…

Representative Results

Die Ergebnisse der "Mikrowellen – sweep" sind in Abbildung 3 dargestellt. Es zeigt , dass die optimale Mikrowellenfrequenz für die [1- 13 C] Pyruvat Probe bei 94,156 GHz für die lokale 3.35-T Hyperpolarisierer ist. Alle folgenden hyperpolarisations Experiment (n = 14) wurden unter Verwendung dieser Mikrowellenfrequenz mit einer Leistung von 100 mW durchgeführt. Die Mikrowellenstrahlung wurde 60 bis 80 min aufgebracht wird, auf einen Festkörper-Hyperpolarisation von mehr als 90% …

Discussion

¹³ CMRSI mit hyperpolarisiertem Sonden ist ein vielversprechendes Verfahren Metabolismus in Echtzeit in vitro zu überwachen und in vivo. Ein sehr wichtiger Aspekt , wenn dieses experimentelle Verfahren verwendet , ist die richtige Standardisierung, insbesondere in – vitro – Experimente in Bezug auf . Erstens muss die Vorbereitung der Probe richtig durchgeführt werden, und stets die gleiche Konzentration von hyperpolarisiertem Material in jedem Versuch zu erzielen. Dies er…

Materials

HyperSense DNP Polariser	Oxford Instruments		3.35 T preclinical DNP hyperpolarizer
GE/Agilent MR901	GE Healthcare/Agilent Technologies		7 T preclinical MRI scanner, with small bore designed for experiments onrodent
Spinsolve Carbon	Magritek		1 T NMR spectrometer with permanent magnet
Deuterium Oxide	Sigma Aldrich	7789-20-0
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	7558-79-4
Sodium phosphate monbasic	Sigma Aldrich	7558-80-7
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	1310-73-2
Disodium edetate	Sigma Aldrich	6381-92-6
Pyruvic acid – 13C1	Cambridge Isotopes Laboratories	CLM-8077-1
Dotarem (0.5 mmol/L)	Guerbet		gadoterate meglumine
tris (8-carboxy-2,2,6,6-tetra-(hydroxyethyl)-benzo-[1,2–4,5]-bis-(1,3)-dithiole-4-yl)-methyl sodium salt (OX063)	GE Healthcare		trityl radical used as a sourse of free electron
PC3 cell line	ATCC	CRL1435
F-12K medium	ATCC	30-2004
Fetal Bovine Serum	ATCC	SCRR-30-2020
Trypsine-EDTA Solution, 1X	ATCC	30-2101
Sample plastic cup	Oxford Instruments
Trypan blue	Bio-Rad	145-0013-MSDS