hiperpolarizado¹³ C Metabolic Espectroscopia de Ressonância Magnética e imagem

Summary

Dynamic nuclear polarization with subsequent sample dissolution has enabled real-time studies of metabolism in biological systems. Hyperpolarized [1-¹³C]pyruvate was used to study lactate dehydrogenase activity in a prostate carcinoma cell line in vitro.

Abstract

Nas últimas décadas, novos métodos para o estadiamento do tumor, reestadiamento, a monitorização da resposta ao tratamento e detecção de recorrência de uma variedade de cânceres têm surgido em conjunto com a tomografia por emissão de positrões state-of-the-art com ¹⁸ F-fluorodeoxyglucose ^([18 F ] -FDG PET). ¹³ C espectroscópica imagiologia de ressonância magnética ⁽¹³ CMRSI) é um método de imagem minimamente invasivo que permite o controlo do metabolismo in vivo e em tempo real. Tal como acontece com qualquer outro método com base em ¹³ C ressonância magnética nuclear (RMN), que enfrenta o desafio de baixa polarização térmica e uma subsequente baixa relação de sinal-para-ruído devido ao relativamente baixo rácio giromagnético de ¹³ C e a sua baixa abundância natural em amostras biológicas. Ao superar estas limitações, a polarização nuclear dinâmica (DNP) com a dissolução da amostra subsequente recentemente habilitado comumente usados ​​sistemas de imagem por ressonância magnética (MRI) RMN e medir, Estudo, e chave vias metabólicas em vários sistemas biológicos. Uma molécula particularmente interessantes e promissoras utilizado em ¹³ CMRSI é [1- ¹³ C] piruvato, que, nos últimos dez anos, tem sido amplamente utilizada para in vitro, pré-clínicos, e, mais recentemente, estudos clínicos para investigar o metabolismo da energia celular em câncer e outras doenças. Neste artigo, vamos delinear a técnica de dissolução DNP usando um pré-clínico hiperpolarizadora DNP 3.35 T e demonstrar seu uso em estudos in vitro. Um protocolo semelhante para a hiperpolarização pode ser aplicado para a maior parte, em estudos in vivo, bem. Para isso, utilizou-se lactato desidrogenase (LDH) e a reacção catalisada metabólica de [1- ¹³ C] piruvato em lactato [1- ¹³ C] em uma linha de células de carcinoma da próstata, PC3, in vitro, utilizando ¹³ CMRSI.

Introduction

Presentemente, o método clínica mais amplamente utilizada para estadiamento do tumor, Reestadiamento, a monitorização da resposta ao tratamento e detecção de recorrência de uma ampla variedade de cancros é ^[18F] -FDG PET. ¹ No entanto, recentemente, várias abordagens novas e alternativas têm surgido. Um desses métodos é de ¹³ CMRSI. Esta técnica envolve a introdução da molécula de ^C-13 em uma amostra biológica, seguido por MRI minimamente invasivo para avaliar o metabolismo in vitro ou in vivo em tempo real. No entanto, o maior desafio de ¹³ CMRSI, em comparação com os outros métodos, tais como ^[18F] -FDG PET ou tomografia computadorizada, é a sua baixa razão sinal-ruído.

O sinal de NMR é directamente proporcional ao nível de polarização, um rácio da diferença população spin ½ núcleos em dois estados de energia à população total (Figura 1A). A polarização é um produto do thrazão E giromagnético (γ) dos núcleos e a intensidade do campo magnético aplicado sobre a temperatura. Um típico de polarização ^1H núcleos é na ordem de 0,001% para 0,005% a 3 T, o que dá uma proporção relativamente baixa de sinal-para-ruído. Hoje MRI state-of-the-art tem sido um método de imagem sucesso apenas devido à grande abundância de ¹ H em amostras biológicas ea relação gyromagnetic alta de ¹ H (y _1H = 42,576 MHz / T). No entanto, observando outros núcleos, tais como o carbono, é mais exigente. A única, de isótopos de carbono magneticamente ativo estável, ¹³ C, torna-se apenas 1,1% de todos os átomos de carbono. Além disso, o rácio giromagnético de ¹³ C _(13C γ = 10,705 MHz / T) é quatro vezes menor do que a de ^um H, conduzindo a uma eficiência de detecção mais baixo. Em resumo, a baixa abundância ^{de 13} C e _{13 C} γ baixo conduzir a medições ¹³ C térmicos para atingir 0,0176% da sensibilidade de um ¹Medição H-RMN in vivo.

Polarização Nuclear dinâmica

Um método para ultrapassar a sensibilidade relativamente fraca de ¹³ medições C é DNP. Foi originalmente descrita para os metais em 1953 por Albert W. Overhauser. No seu artigo, ele afirma: "Verificou-se que, se a ressonância de spin electrónico dos electrões de condução é saturada, os núcleos irão ser polarizadas no mesmo grau que seria se a sua proporção giromagnética fosse o do spin do electrão." ² Mais tarde Naquele ano, Carver e Slichter confirmada experimentalmente a hipótese de Overhauser ^3. Em 1958, Abragam e Proctor descreveu este efeito para os elétrons em líquidos e nomeou-o "efeito sólido". A temperaturas inferiores a 4 K,-spin do electrão polarização atinge cerca de 100% e é mais do que três ordens de magnitude maior do que a polarização-spin nuclear (Figura 1B) ^4. Tsua ocorre porque o rácio giromagnético do electrão (γ _e = 28024,944 MHz / T) é três ordens de grandeza maior do que os rácios gyromagnetic nucleares. As interacções fracas entre electrões e núcleos, tais como o efeito de Overhauser, o efeito sólido, o efeito transversal, e o efeito de mistura térmica, permitir a transferência de polarização de electrões gira para spins nucleares utilizando a irradiação de microondas com uma frequência perto do electrão correspondente ressonância paramagnética (EPR) ^5,6 frequência. teoria DNP tem sido desenvolvido para envolver mais elétrons e mistura térmica. No entanto, até à data, nenhuma descrição teórica quantitativa unificado de DNP foi publicado ^7,8.

Figura 1: compreensão dinâmica Polarização Nuclear e Hiperpolarização. A) Uma comparação esquemática da população de spinno estado de equilíbrio polarização térmica e o estado hiperpolarizado. B) A polarização é dependente da temperatura. A polarização de um electrão (e ^-) atinge 100% abaixo de 1.4 K. O DNP permite a transferência da polarização do electrónico para os núcleos ^{de 13} C, o que aumenta a sua polarização até 10 vezes de ^5. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para introduzir DNP em estudos de sistemas biológicos utilizando ¹³ C RMN, subsequente dissolução rápida amostra tinha de ser desenvolvido. 50 anos após a hipótese de Overhauser, Jan H. Ardenkjaer-Larsen et al. resolveu a questão tecnicamente difícil de levar a amostra congelada hyperpolarized no estado líquido com perda mínima hiperpolarização ^6. Dissolução DNP abriu um novo campo de pesquisa chamado ¹³ CMRSI, fornecendo um novo método para investigar e caracterizar vários estados de doença ^9,10. como portadores estáveis ​​de um elétron não emparelhado, a tritil tris radical (8-carboxi-2,2,6,6-tetra- (hidroxietil) -benzo- [1,2-4,5] -bis- (1,3) -dithiole-4-il) -metil sal de sódio (OX063) ou (2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-il) oxilo (TEMPO) é normalmente utilizado. Estes são misturados com a molécula desejada marcada com ¹³ C e exposto a irradiação de microondas com uma frequência perto da frequência de EPR correspondente. Usando esta técnica, a polarização dos núcleos de ¹³ C pode ser aumentada até 37% ^11. Isto resulta num aumento de polarização 10 vezes de ⁵ em comparação com a polarização equilíbrio térmico ^11,12. No entanto, logo que a irradiação de microondas é parado e / ou o ^C-13 molécula é transferida para o estado líquido, a polarização decai com o tempo de relaxamento longitudinal _(T1) do núcleo ¹³ C, que foi polarizada. Assim, oinvenção de técnicas de rápida dissolução ou qualquer técnica subsequente redução do tempo antes da medição experimental (isto é, injecção) é crucial para aplicações biológicas ^13.

Há três requisitos principais que a molécula candidato precisa cumprir para bem sucedidos ¹³ estudos CMRSI. Em primeiro lugar, o núcleo ¹³ C de interesse tem de ter um tempo suficientemente longo T ₁ (> 10 s). A escolha da etiqueta ^C-13 é crucial. Os melhores núcleos candidatos são carbonos sem contacto directo com ¹ H-núcleos através de uma ligação. Também tem de ser rapidamente metabolizado dentro de 2 – 3 vezes ₁ T, resultando em um produto metabólico a jusante com um desvio químico muito diferente da substância original. A mistura da amostra deve também formar um vidro amorfo quando em estado sólido de modo a que a distribuição espacial diminui a distância entre o electrão e ¹³ C, permitindo que o transfer de polarização. Se a molécula candidata não formar vidro amorfo, naturalmente, que deve ser altamente solúvel em um agente de envidraçamento, tal como o glicerol ou o sulfóxido de dimetilo ^14. Estes requisitos resultar num número relativamente pequeno de moléculas candidatas. No entanto, mesmo depois da descoberta bem sucedida de uma molécula adequada, o desenvolvimento de um protocolo de trabalho para a hiperpolarização pode ser tecnicamente exigente ^9,14,15.

Nos últimos anos, vários substratos foram com sucesso polarizada, tal como [1- ¹³ C] piruvato ^{12,16 – 36,} [2- ¹³ C] piruvato ^37, [1- ¹³ C] etil piruvato ^38, [1- ¹³ C ] lactato ^39, [1- ¹³ C] fumarato ^{40 – 43, 13} C-bicarbonato ^36,44,45, [1- ¹³ C] acetato de sódio ^{43,46 – 49, 13} C-ureia ^6,36,50,51 , [5- ¹³ C] glutami^15,52,53 NE, [1- ¹³ C] glutamato ^53,54, [1- ¹³ C] 2-oxoglutarato ^55, [1- ¹³ C] alanina, e outros ^14,56. Um substrato particularmente interessante e utilizada para hiperpolarização é [1- ¹³ C] piruvato. É amplamente utilizada em estudos pré-clínicos para investigar a energia do metabolismo celular em várias doenças ^14,17,22. [1- ¹³ C] piruvato preenche todos os requisitos para hiperpolarização bem sucedida, incluindo um transporte relativamente longo T ₁ e rápida através da membrana celular antes posteriormente ser metabolizado. Estudos pré-clínicos com piruvato [1- ¹³ C] estão actualmente a ser traduzido para a clínica ^57.

Metabolismo do piruvato

É bem conhecido que existe uma relação directa entre as mutações no DNA e alterações nas suas vias metabólicas de células cancerosas. Já na década de 1920, Otto Warburg Discovrado que há um aumento do metabolismo de glucose e produção de lactato em tumores em comparação com tecidos saudáveis ^58-60. Subsequentemente, várias alternâncias em outras vias metabólicas, tais como a via de pentoses fosfato, o ciclo de ácido tricarboxílico, fosforilação oxidativa e da síntese de nucleótidos e lípidos, têm sido descritas.

O piruvato é o produto final da glicólise. No tumor, ele sofre da glicólise anaeróbia catalisada pela LDH ⁶¹ e reage com a forma reduzida da nicotinamida adenina dinucleótido coenzima (NADH), o que resulta em lactato e a forma oxidada da coenzima (NAD ^+). Alternativamente, o piruvato é submetido a uma reacção de transaminação com o glutamato para formar alanina, catalisada por transaminase alanina (ALT). Ambas as reacções são prontamente reversível. Piruvato também sofre descarboxilação catalisada pela desidrogenase de piruvato (PDH) para dióxido de carbono e acetil-CoA, representing uma reacção irreversível neste passo. Alternâncias nestas taxas de reacção pode ser ligada ao metabolismo do tumor ^{17,21,22,25,62.} As vias metabólicas estão resumidos na Figura 2.

Figura 2: Diagrama das principais reacção metabólica do piruvato. / Conversão de lactato piruvato é catalisada pela LDH, e conversão de piruvato / alanina é catalisada por ALT. O piruvato é irreversivelmente convertida a acetil-CoA e de CO ₂ por PDH, e CO ₂ está num equilíbrio dependente do pH com bicarbonato de ^80. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A detecção de hiperpolarizado [1- ¹³ C] piruvato e seus metabolitos foi previamente demonstrada no rato, elearte ^{37,63 – 65, 66} fígado, músculo, rim e ^62,67. Um estudo demonstrou diferenças significativas na relação lactato-to-alanina entre o fígado normal e em jejum de rato ⁶⁶ e demonstraram um [1- ¹³ C] nível de lactato altamente elevada e hyperpolarized no cancro do fígado ^68,69. Há evidências de que o grau do tumor pode ser identificada num adenocarcinoma transgénico da próstata de ratinho (TRAMP) usando hiperpolarizado piruvato [1- ¹³ C] ^22, com os níveis de lactato hiperpolarizados que mostram uma elevada correlação com o grau histológico dos tumores excisados. A alanina a partir do piruvato catalisada por ALT foi também sugerida como um marcador útil no rato carcinoma hepatocelular ^23.

Medindo o fluxo metabólico piruvato-lactato foi usado para monitorização isquemia ^63,65,70 e como uma resposta ao tratamento com drogas citotóxicas quimioterapia ^17,40, segmentados <sup> 24,25,41, ²⁶ ou radioterapia em modelos animais. Também tem sido utilizado para a detecção do fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) inibidor da resposta LY294002 em glioblastoma e o cancro da mama modelos de ratos ^25. Alterações no metabolismo do piruvato em tumores cerebrais ²⁶ e o cancro da próstata ^24,71 também foram observadas após o tratamento.

próstata Carcinoma

Carcinoma da próstata é o cancro predominante em homens idosos e o segundo câncer líder envolvidos na morte de homens em todo o mundo ^72. Até o momento, não há métodos confiáveis e não-invasivos estão disponíveis para o diagnóstico precoce e caracterização de câncer de próstata ^73,74, enfatizando a necessidade urgente de técnicas de imagem metabólica novos para permitir a detecção rigorosa e estadiamento dos pacientes. Carcinoma da próstata foi usado como um modelo para demonstrar as possibilidades da DNP dissolução combinados com ¹³ CMRSI no pacienteS ^57. Este trabalho foi continuado em um primeiro ensaio clínico utilizando [1- ¹³ C] piruvato e ¹³ CMRSI para a imagem do câncer de próstata, e tem apenas recentemente foi concluída (NCT01229618).

A motivação por trás deste trabalho foi ilustrar em mais detalhe e para um público mais amplo a aplicação do método CMRSI ¹³ em um cenário pré-clínico com células. Medir o metabolismo catalisado-LDH de [1- ¹³ C] piruvato para [1- ¹³ C] lactato in vitro na linha de células de carcinoma da próstata PC3, demonstramos a eventual aplicação do DNP dissolução em estudos in vitro e abordar os passos cruciais e desafios durante os experimentos.

Protocol

1. Amostra Preparação da Solução Adicionar gadoterate meglumina (GADM, 0,5 mol / L) de concentrado [1- 13 C] ácido pirúvico para dar uma concentração final de 1-mmol / L GADM. Adicionar tritilo radical tris (8-carboxi-2,2,6,6-tetra- (hidroxietil) -benzo- [1,2-4,5] -bis- (1,3) -dithiole-4-il) – sal de sódio de metilo (OX063) a esta mistura para dar uma concentração final de 15 mmol / L. Vórtice até à dissolução completa. NOTA: Esta preparação de soluções de é projetado pa…

Representative Results

Os resultados do "varrimento microondas" são ilustrados na Figura 3. Ele mostra que a frequência de microondas ideal para a [1- 13 C] é a amostra de piruvato 94,156 GHz para o hiperpolarizadora 3,35-T local. Todos hiperpolarização seguinte experiência (n = 14) foram realizados utilizando esta frequência de microondas, com uma potência de 100 mW. A irradiação de microondas foi aplicada durante 60 a 80 minutos, levando a uma hiperpolarização de estado sólido superior a 90…

Discussion

¹³ CMRSI com sondas hiperpolarizados é um método promissor para monitorizar em tempo real o metabolismo in vitro e in vivo. Um aspecto muito importante quando se emprega este processo experimental é a padronização adequada, especialmente em relação experimentos in vitro. Em primeiro lugar, a preparação da amostra tem de ser feito de forma adequada e consistente para conseguir a mesma concentração de material hiperpolarizado em cada experiência. Isto requer uma pesagem pr…

Materials

HyperSense DNP Polariser	Oxford Instruments		3.35 T preclinical DNP hyperpolarizer
GE/Agilent MR901	GE Healthcare/Agilent Technologies		7 T preclinical MRI scanner, with small bore designed for experiments onrodent
Spinsolve Carbon	Magritek		1 T NMR spectrometer with permanent magnet
Deuterium Oxide	Sigma Aldrich	7789-20-0
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	7558-79-4
Sodium phosphate monbasic	Sigma Aldrich	7558-80-7
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	1310-73-2
Disodium edetate	Sigma Aldrich	6381-92-6
Pyruvic acid – 13C1	Cambridge Isotopes Laboratories	CLM-8077-1
Dotarem (0.5 mmol/L)	Guerbet		gadoterate meglumine
tris (8-carboxy-2,2,6,6-tetra-(hydroxyethyl)-benzo-[1,2–4,5]-bis-(1,3)-dithiole-4-yl)-methyl sodium salt (OX063)	GE Healthcare		trityl radical used as a sourse of free electron
PC3 cell line	ATCC	CRL1435
F-12K medium	ATCC	30-2004
Fetal Bovine Serum	ATCC	SCRR-30-2020
Trypsine-EDTA Solution, 1X	ATCC	30-2101
Sample plastic cup	Oxford Instruments
Trypan blue	Bio-Rad	145-0013-MSDS