hyperpolarized¹³ C metabolica spettroscopia di risonanza magnetica e Imaging

Summary

Dynamic nuclear polarization with subsequent sample dissolution has enabled real-time studies of metabolism in biological systems. Hyperpolarized [1-¹³C]pyruvate was used to study lactate dehydrogenase activity in a prostate carcinoma cell line in vitro.

Abstract

Negli ultimi decenni, nuovi metodi per la stadiazione del tumore, ristadiazione, monitoraggio risposta al trattamento, e la rilevazione ricorrenza di una varietà di tumori sono emersi in concomitanza con la tomografia state-of-the-art emissione di positroni con ¹⁸ F-fluorodeossiglucosio ^([18 F ] -FDG PET). ¹³ C spettroscopia imaging a risonanza magnetica ⁽¹³ CMRSI) è un metodo di imaging minimamente invasivo che permette il controllo del metabolismo in vivo ed in tempo reale. Come con qualsiasi altro metodo basato su ¹³ C risonanza magnetica nucleare (NMR), affronta la sfida di bassa polarizzazione termica e una successiva basso rapporto segnale-rumore dovuto alla relativamente basso rapporto giromagnetico di ¹³ C e la sua bassa abbondanza naturale in campioni biologici. Superando questi limiti, la polarizzazione nucleare dinamica (DNP), con conseguente scioglimento del campione ha recentemente permesso comunemente utilizzati sistemi di imaging a risonanza magnetica (MRI) NMR e misurare, Lo studio, e di immagine principali vie metaboliche nei vari sistemi biologici. Una molecola particolarmente interessante e promettente utilizzato in ¹³ CMRSI è [1- ¹³ C] piruvato, che, negli ultimi dieci anni, è stato ampiamente utilizzato in vitro, preclinici, e, più recentemente, studi clinici per indagare il metabolismo energetico cellulare nel cancro e altre malattie. In questo articolo, descriviamo la tecnica di scioglimento DNP utilizzando un 3.35 T preclinico hyperpolarizer DNP e dimostrare il suo utilizzo in studi in vitro. Un protocollo simile per iperpolarizzazione può essere applicato per la maggior parte in studi in vivo pure. Per farlo, abbiamo utilizzato lattato deidrogenasi (LDH) e catalizzato la reazione metabolica di [1- ¹³ C] piruvato in [1- ¹³ C] lattato in una linea di cellule di carcinoma della prostata, PC3, in vitro utilizzando ¹³ CMRSI.

Introduction

Attualmente, il metodo clinico più utilizzato per la stadiazione del tumore, ristadiazione, monitoraggio risposta al trattamento, e la rilevazione ricorrenza di una vasta gamma di tumori è ^[18 F] -FDG PET. ¹ Tuttavia, recentemente, diversi approcci nuovi e alternativi sono emersi. Uno di questi metodi è ¹³ CMRSI. Questa tecnica prevede l'introduzione del ¹³ C-molecola in un campione biologico, seguita da MRI minimamente invasiva per valutare il metabolismo in vitro o in vivo in tempo reale. Tuttavia, la sfida del ¹³ CMRSI, rispetto agli altri metodi come ^[18 F] -FDG PET o tomografia computerizzata, è il basso rapporto segnale-rumore.

Il segnale NMR è direttamente proporzionale al livello di polarizzazione, un rapporto tra la differenza di popolazione di spin ½ nuclei in due stati di energia alla popolazione totale (Figura 1A). La polarizzazione è un prodotto di the rapporto giromagnetico (γ) dei nuclei e l'intensità del campo magnetico applicato sopra la temperatura. Una polarizzazione tipica di ¹ H nuclei è dell'ordine di 0,001% a 0,005% a 3 T, che dà una relativamente scarsa rapporto segnale-rumore. Odierna state-of-the-art MRI è stato un metodo di imaging successo solo a causa della grande abbondanza di ¹ H in campioni biologici e l'elevato rapporto giromagnetico di ¹ H (γ _1H = 42,576 MHz / T). Tuttavia, osservando altri nuclei, come carbonio, è più esigente. L'unica stabile, isotopo di carbonio magneticamente attivi, ¹³ C, costituisce solo l'1,1% di tutti gli atomi di carbonio. Inoltre, il rapporto giromagnetico di ¹³ C (γ _13C = 10.705 MHz / T) è quattro volte inferiore a quella del ¹ H, portando ad una efficienza di rivelazione inferiore. In sintesi, la scarsa abbondanza ¹³ C e bassa _13C γ causano misurazioni ¹³ C termici per raggiungere 0,0176% della sensibilità di un ¹Misurazione H-NMR in vivo.

Polarizzazione nucleare dinamica

Un metodo per superare la relativamente scarsa sensibilità di ¹³ misurazioni C è DNP. E 'stato originariamente descritto per i metalli nel 1953 da Albert W. Overhauser. Nel suo articolo, afferma: "Si dimostra che se la risonanza di spin elettronico degli elettroni di conduzione è saturo, i nuclei vengono polarizzati nella stessa misura sarebbero se il loro rapporto giromagnetico fosse quello dello spin dell'elettrone." ² tardi quell'anno, Carver e Slichter sperimentalmente confermato l'ipotesi di Overhauser ^3. Nel 1958, Abragam e Proctor descritti questo effetto per gli elettroni nei liquidi e chiamarono "l'effetto solido." A temperature inferiori a 4 K, electron spin polarizzazione raggiunge quasi il 100% ed è più di tre ordini di grandezza superiore al nucleare polarizzazione di spin (Figura 1B) ^4. Tla verifica perché il rapporto giromagnetico dell'elettrone (γ _e = 28024,944 MHz / T) è di tre ordini di grandezza superiore al rapporto giromagnetico nucleari. Le interazioni deboli tra elettroni e nuclei, come l'effetto Overhauser, l'effetto solido, l'effetto trasversale, e l'effetto di miscelazione termica, consentono il trasferimento di polarizzazione da electron spin a spin nucleari mediante irradiazione a microonde con una frequenza prossima al corrispondente elettroni risonanza paramagnetica (EPR) ^5,6 frequenza. teoria DNP è stato ulteriormente sviluppato per coinvolgere più elettroni e miscelazione termica. Tuttavia, ad oggi, non unificato descrizione quantitativa teorica di DNP è stato pubblicato ^7,8.

Figura 1: comprensione dinamica di polarizzazione nucleare e Iperpolarizzazione. A) Un confronto schematica della popolazione di spinnello stato di equilibrio di polarizzazione termico e lo stato iperpolarizzato. B) La polarizzazione dipende dalla temperatura. La polarizzazione di un elettrone (e ^-) raggiunge il 100% inferiore a 1,4 K. Il DNP permette il trasferimento della polarizzazione dalla e- ai ¹³ C nuclei, che aumenta la polarizzazione fino a 10 ⁵ fold. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Per introdurre DNP negli studi di sistemi biologici utilizzando ¹³ C NMR, successivo scioglimento rapido del campione doveva essere sviluppato. 50 anni dopo l'ipotesi di Overhauser, Jan H. Ardenkjaer-Larsen et al. risolto il problema tecnicamente impegnativo di portare il campione congelato iperpolarizzato allo stato liquido con una perdita minima iperpolarizzazione ^6. Scioglimento DNP ha aperto un nuovo campo di ricerca chiamato ¹³ CMRSIo, che fornisce un nuovo metodo per studiare e caratterizzare i vari stati di malattia ^9,10. Come vettori stabili di un elettrone spaiato, un tritile tris radicale (8-carbossi-2,2,6,6-tetra (idrossietil) -benzo- [1,2-4,5] bis- (1,3) -dithiole-4-il) -metil sale di sodio (OX063) o oxyl (2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-il) (TEMPO) è di solito utilizzato. Questi sono mescolati con ¹³ molecola di C-marcato desiderata e esposti a irradiazione a microonde con una frequenza vicina alla frequenza corrispondente EPR. Usando questa tecnica, la polarizzazione di ¹³ C nuclei può essere aumentata fino al 37% ^11. Ciò si traduce in un 10 ⁵ fold miglioramento polarizzazione rispetto all'equilibrio termico di polarizzazione ^11,12. Tuttavia, non appena l'irraggiamento a microonde è fermo e / o ¹³ C-molecola viene trasferito allo stato liquido, la polarizzazione decade con il tempo di rilassamento longitudinale (T ₁₎ del nucleo ¹³ C che è stato polarizzato. Così, lainvenzione di tecniche di dissoluzione veloce o qualsiasi successiva tecnica accorciando il tempo prima misura sperimentale (ad esempio, l'iniezione) è di fondamentale importanza per le applicazioni biologiche ^13.

Ci sono tre requisiti principali che la molecola candidato deve soddisfare per successo ¹³ studi CMRSI. Innanzitutto, il nucleo ¹³ C di interesse deve avere un tempo sufficientemente lungo T ₁ (> 10 s). La scelta del ¹³ C-label è cruciale. Le migliori nuclei candidati sono atomi di carbonio con alcun contatto diretto con ¹ H-nuclei tramite un legame. Inoltre deve essere rapidamente metabolizzato entro 2 – 3 T ₁ volte, risultando in un prodotto metabolico a valle con una significativamente diverso chemical shift dalla sostanza originale. La miscela campione deve inoltre formare un vetro amorfo allo stato solido in modo che la distribuzione spaziale diminuisce la distanza tra l'elettrone e ¹³ C, permettendo transFer di polarizzazione. Se la molecola candidata non forma vetrosa amorfa naturalmente, deve essere altamente solubile in un agente glassing, come il glicerolo o dimetilsolfossido ^14. Questi requisiti comportano un numero relativamente piccolo di molecole candidate. Tuttavia, anche dopo la scoperta di successo di una molecola adatta, sviluppando un protocollo di lavoro per iperpolarizzazione può essere tecnicamente impegnativo ^9,14,15.

Negli ultimi anni, diversi substrati sono stati correttamente polarizzata, ad esempio [1- ¹³ C] piruvato ^{12,16 – 36,} [2- ¹³ C] piruvato ^37, [1- ¹³ C] etil piruvato ^38, [1- ¹³ C ] lattato ^39, [1- ¹³ C] fumarato ^{40-43, 13} C-bicarbonato ^36,44,45, [1- ¹³ C] acetato di sodio ^{43,46 – 49, 13} C-urea ^6,36,50,51 , [5- ¹³ C] glutamine ^15,52,53, [1- ¹³ C] glutammato ^53,54, [1- ¹³ C] 2-oxoglutarato ^55, [1- ¹³ C] alanina, e altri ^14,56. Un substrato particolarmente interessante e comunemente usato per iperpolarizzazione è [1- ¹³ C] piruvato. E 'ampiamente utilizzato negli studi preclinici per indagare il cellulare energetico del metabolismo in varie malattie ^14,17,22. [1- ¹³ C] piruvato soddisfa tutti i requisiti per iperpolarizzazione successo, compreso un relativamente lungo T ₁ e rapido trasporto attraverso la membrana cellulare prima successivamente essere metabolizzata. Gli studi preclinici con [1- ¹³ C] piruvato vengono attualmente tradotte in clinica ^57.

Il metabolismo del piruvato

E 'ben noto che vi è un legame diretto tra le mutazioni nel DNA e cambiamenti nelle loro vie metaboliche un cancro cellule. Già nel 1920, Otto Warburg scoEred che vi è un aumento del metabolismo del glucosio e la produzione di lattato in tumori rispetto al tessuto sano ^{58 – 60.} Successivamente, varie alternanze di altre vie metaboliche, come la via dei pentoso-fosfati, il ciclo degli acidi tricarbossilici, fosforilazione ossidativa e la sintesi dei nucleotidi e lipidi, sono stati descritti.

Il piruvato è il prodotto finale della glicolisi. Nel tumore, subisce glicolisi anaerobica catalizzata dalla LDH ⁶¹ e reagisce con la forma ridotta del coenzima nicotinamide adenina dinucleotide (NADH), con conseguente lattato e la forma ossidata del coenzima (NAD ^+). In alternativa, piruvato subisce una reazione di transaminazione con glutammato per formare alanina, catalizzata da alanina transaminasi (ALT). Entrambe le reazioni sono facilmente reversibili. Piruvato subisce decarbossilazione catalizzata dalla piruvato deidrogenasi (PDH) in anidride carbonica e acetil-CoA, representing una reazione irreversibile, in questa fase. Alternanze di queste velocità di reazione possono essere collegati al metabolismo tumorale ^{17,21,22,25,62.} Le vie metaboliche sono riassunti nella figura 2.

Figura 2: Schema del forte reazione metabolica del piruvato. Piruvato / conversione del lattato è catalizzata dalla LDH, e la conversione piruvato / alanina è catalizzata da ALT. Il piruvato è irreversibilmente convertito in acetil-CoA e CO ₂ di PDH, e CO ₂ è in un equilibrio pH-dipendente con bicarbonato ^80. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Il rilevamento di iperpolarizzato [1- ¹³ C] piruvato e dei suoi metaboliti è stata precedentemente dimostrata nel ratto haArte ^{37,63 – 65,} del fegato ^66, muscoli, reni e ^62,67. Uno studio ha dimostrato differenze significative nel rapporto lattato-to-alanina tra il normale e digiuno fegato di ratto ⁶⁶ e dimostrato un [1- ¹³ C] livello lattato altamente elevato e iperpolarizzato nel cancro del fegato ^68,69. Ci sono prove che il grado del tumore può essere identificato in un adenocarcinoma prostatico transgenico di mouse (TRAMP) utilizzando hyperpolarized [1- ¹³ C] piruvato ^22, con i livelli di lattato hyperpolarized che mostrano una forte correlazione con il grado istologico dei tumori asportati. L'alanina catalizzata dalla piruvato dal ALT stato anche suggerito come marker utile nel ratto carcinoma epatocellulare ^23.

La misurazione del flusso metabolico piruvato-lattato è stato utilizzato per il monitoraggio di ischemia ^63,65,70 e come risposta al trattamento con farmaci chemioterapia citotossica ^17,40, mirati <sup> 24,25,41, ²⁶ o radioterapia in modelli animali. E 'stato utilizzato anche per il rilevamento della fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K) inibitore della risposta LY294002 nel glioblastoma e il cancro al seno modelli murini ^25. I cambiamenti nel metabolismo del piruvato in tumori cerebrali ²⁶ e il cancro alla prostata ^24,71 sono stati osservati anche dopo il trattamento.

Carcinoma della prostata

Il carcinoma della prostata è il cancro predominante negli uomini anziani e il secondo tumore che porta legate alla morte negli uomini in tutto il mondo ^72. Ad oggi, esistono metodi affidabili, non invasivi sono disponibili per una diagnosi precoce e caratterizzazione di cancro alla prostata ^73,74, sottolineando la necessità urgente di nuove tecniche di imaging metabolico per consentire la rilevazione rigorosa e la stadiazione dei pazienti. Carcinoma della prostata è stato usato come modello per dimostrare le possibilità di dissoluzione DNP combinati con ¹³ CMRSI nel pazienteS ^57. Questo lavoro è stato continuato in un primo studio clinico che impiegano [1- ¹³ C] piruvato e ¹³ CMRSI per l'imaging del cancro alla prostata, ed è proprio di recente è stato completato (NCT01229618).

La motivazione di questo lavoro era di illustrare più in dettaglio e per un pubblico più vasto l'applicazione del metodo CMRSI ¹³ in un ambiente preclinico con le cellule. Misurare il metabolismo LDH-catalizzata di [1- ¹³ C] piruvato di [1- ¹³ C] lattato in vitro nella linea di cellule di carcinoma della prostata PC3, dimostriamo l'eventuale applicazione di scioglimento DNP negli studi in vitro e affrontare i punti cruciali e sfide durante gli esperimenti.

Protocol

1. Campione della soluzione Stock Preparazione Aggiungere gadoterate meglumina (GadM, 0,5 mol / L) per concentrato [1- 13 C] acido piruvico per dare una concentrazione finale di 1-mmol / L GadM. Aggiungere tritile tris radicale (8-carbossi-2,2,6,6-tetra (idrossietil) -benzo- [1,2-4,5] bis- (1,3) -dithiole-4-il) – sale di sodio metil (OX063) a questa miscela per ottenere una concentrazione finale di 15 mmol / L. Vortex fino a completa dissoluzione. NOTA: Questa preparazione magazzino soluzion…

Representative Results

I risultati del "microonde sweep" sono illustrati in Figura 3. Essa mostra che la frequenza delle microonde ottimale per [1- 13 C] campione piruvato è a 94,156 GHz per l'hyperpolarizer 3,35-T locale. Tutti seguente esperimento iperpolarizzazione (n = 14) sono state eseguite utilizzando questa frequenza a microonde con una potenza di 100 mW. L'irradiazione a microonde è stata applicata per 60 a 80 minuti, portando ad una iperpolarizzazione stato solido superiore al 90%. I r…

Discussion

¹³ CMRSI con sonde hyperpolarized è un metodo promettente per monitorare in tempo reale il metabolismo in vitro e in vivo. Un aspetto molto importante quando si impiega questo processo sperimentale è la corretta normalizzazione, soprattutto per quanto riguarda gli esperimenti in vitro. Innanzitutto, la preparazione del campione deve essere fatto correttamente e costantemente per ottenere la stessa concentrazione di materiale iperpolarizzato in ogni esperimento. Ciò richi…

Materials

HyperSense DNP Polariser	Oxford Instruments		3.35 T preclinical DNP hyperpolarizer
GE/Agilent MR901	GE Healthcare/Agilent Technologies		7 T preclinical MRI scanner, with small bore designed for experiments onrodent
Spinsolve Carbon	Magritek		1 T NMR spectrometer with permanent magnet
Deuterium Oxide	Sigma Aldrich	7789-20-0
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	7558-79-4
Sodium phosphate monbasic	Sigma Aldrich	7558-80-7
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	1310-73-2
Disodium edetate	Sigma Aldrich	6381-92-6
Pyruvic acid – 13C1	Cambridge Isotopes Laboratories	CLM-8077-1
Dotarem (0.5 mmol/L)	Guerbet		gadoterate meglumine
tris (8-carboxy-2,2,6,6-tetra-(hydroxyethyl)-benzo-[1,2–4,5]-bis-(1,3)-dithiole-4-yl)-methyl sodium salt (OX063)	GE Healthcare		trityl radical used as a sourse of free electron
PC3 cell line	ATCC	CRL1435
F-12K medium	ATCC	30-2004
Fetal Bovine Serum	ATCC	SCRR-30-2020
Trypsine-EDTA Solution, 1X	ATCC	30-2101
Sample plastic cup	Oxford Instruments
Trypan blue	Bio-Rad	145-0013-MSDS