hyperpolariseret¹³ C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy og Imaging

Summary

Dynamic nuclear polarization with subsequent sample dissolution has enabled real-time studies of metabolism in biological systems. Hyperpolarized [1-¹³C]pyruvate was used to study lactate dehydrogenase activity in a prostate carcinoma cell line in vitro.

Abstract

I de seneste årtier har nye metoder til tumor iscenesættelse, genopsætning, behandlingsrespons overvågning og gentagelse påvisning af en række forskellige kræftformer opstod i forbindelse med positronemissionstomografi state-of-the-art med ¹⁸ F-fluorodeoxyglukose ^([18 F ] -FDG PET). ^13C magnetisk resonans spektroskopisk imaging ⁽¹³ CMRSI) er en minimalt invasiv billeddannelse metode, som tillader overvågning af metabolisme in vivo og i realtid. Som med enhver anden metode baseret på ^13C kernemagnetisk resonans (NMR), det står over for den udfordring at lave termiske polarisering og et efterfølgende lavt signal-støj-forhold på grund af den relativt lave gyromagnetiske forhold på ¹³ C og dets lave naturlige forekomst i biologiske prøver. Ved at overvinde disse begrænsninger har dynamisk nukleare polarisering (DNP) med opløsning efterfølgende prøve nylig aktiveret almindeligt anvendte NMR og magnetisk resonans imaging (MRI) systemer til at måle, Undersøgelse, og image vigtige metaboliske veje i forskellige biologiske systemer. Et særligt interessante og lovende molekyle anvendt i ¹³ CMRSI er [1- ^13C] pyruvat, som i de sidste ti år, har været meget anvendt til in vitro, præklinisk, og på det seneste, kliniske undersøgelser for at undersøge den cellulære energimetabolisme ved cancer og andre sygdomme. I denne artikel, vi skitsere teknik opløsning DNP brug af en 3,35 T præklinisk DNP hyperpolarisator og demonstrere dens anvendelse i in vitro-studier. En lignende protokol for hyperpolarisering kan anvendes for det meste i in vivo studier så godt. For at gøre dette har vi brugt lactatdehydrogenase (LDH) og katalyserede den metaboliske omsætning af [1- ^13C] pyruvat til [1- ^13C] lactat i en prostata carcinom-cellelinje, PC3, in vitro under anvendelse ¹³ CMRSI.

Introduction

I øjeblikket er den mest udbredte kliniske fremgangsmåde til tumor staging, genopsætning, behandlingsrespons overvågning, og fornyet påvisning af en lang række forskellige cancere er ^[18F] -FDG PET. ¹ Men for nylig, flere nye og alternative tilgange er dukket op. En af disse metoder er ¹³ CMRSI. Denne teknik indebærer indførelsen af ^{13C-molekylet} til en biologisk prøve, efterfulgt af minimalt invasiv MRI at vurdere metabolisme in vitro eller in vivo i realtid. Alligevel den største udfordring af ^13. CMRSI, sammenlignet med de andre metoder, såsom ^[18F] -FDG PET eller computertomografi, er dens lave signal-til-støj-forhold.

NMR-signal er direkte proportional med niveauet af polarisation, et forhold af spin ½ kerner population forskel i to energitilstande til den samlede befolkning (figur 1A). Den polarisering er et produkt af the gyromagnetiske forhold (γ) af kernerne og den anvendte magnetiske feltstyrke over temperaturområdet. En typisk polarisering på ¹ time kerner er i størrelsesordenen 0,001% til 0,005% ved 3 T, hvilket giver et relativt dårligt signal-støj-forhold. Dagens state-of-the-art MRI har været en vellykket billeddannelse metode kun på grund af den høje forekomst af ^1H i biologiske prøver og den høje gyromagnetiske forhold af ¹ H (y _1H = 42,576 MHz / T). Men observere andre kerner, såsom kul, er mere krævende. Det eneste stabile, magnetisk aktivt kul isotop, ^13C, kun udgør 1,1% af alle kulstofatomer. Derudover gyromagnetiske forhold på ^13C (γ _13C = 10,705 MHz / T) er fire gange lavere end for ^1H, hvilket fører til en lavere afsløring effektivitet. Sammenfattende lav ^13C overflod og lav γ _13C forårsage termiske målinger ¹³ C til opnåelse af 0,0176% af følsomheden af en ¹H-NMR-måling in vivo.

Dynamisk Nuklear Polarisering

Fremgangsmåde til at overvinde den relativt ringe følsomhed på ¹³ C-målinger er DNP. Det blev oprindeligt beskrevet for metaller i 1953 af Albert W. Overhauser. I sin artikel, udtalte han: "Det er vist, at hvis den elektron spin resonans af ledningsforstyrrelser elektroner er mættet, vil kernerne blive polariseret i samme grad de ville være, hvis deres gyromagnetiske forhold var, at elektronens spin." ² Senere det år, Carver og Slichter eksperimentelt bekræftet Overhauser hypotese ^3. I 1958 Abragam og Proctor beskrevet denne effekt for elektroner i væsker og kaldte det den "solid effekt." Ved temperaturer under 4 K, elektron-spin-polarisering når næsten 100% og er mere end tre størrelsesordener højere end den nukleare-spin-polarisation (figur 1B) ^4. Thans opstår, fordi gyromagnetiske forholdet mellem elektron (γ _e = 28024,944 MHz / T) er tre størrelsesordener højere end de nukleare gyromagnetiske nøgletal. De svage interaktioner mellem elektroner og kerner, såsom Overhauser effekt, den faste retning indlæg virkning, og den termiske blanding virkning, tillade overførsel af polarisering fra elektron spins at kernespin ved hjælp mikrobølgebestråling med en frekvens tæt på den tilsvarende elektron paramagnetiske resonans (EPR) frekvens ^5,6. DNP teori er blevet videreudviklet til at involvere flere elektroner og termisk blanding. Alligevel til dato ingen samlet kvantitativ teoretisk beskrivelse af DNP er offentliggjort ^7,8.

Figur 1: Forståelse Dynamic Nuclear Polarisation og hyperpolarisering. A) En skematisk sammenligning af spin befolkningi termisk ligevægt polarisering staten og den hyperpolariserede tilstand. B) Polariseringen er afhængig af temperatur. Polariseringen af en elektron (e ^-) når 100% under 1,4 K. DNP muliggør overførsel af polarisationen fra e til de ¹³ C-kerner, hvilket øger deres polarisation op til 10 ⁵ fold. Klik her for at se en større version af dette tal.

At indføre DNP i studier af biologiske systemer, der anvender ^13C NMR, efterfølgende opløsning hurtig prøve havde skal udvikles. 50 år efter Overhauser hypotese, Jan H. Ardenkjaer-Larsen et al. løst teknisk udfordrende spørgsmål om at bringe den hyperpolariserede frosne prøve i flydende tilstand med minimal hyperpolarisering tab ^6. Opløsning DNP åbnede en ny forskningsområde kaldet ¹³ CMRSI, hvilket giver en ny metode til at undersøge og karakterisere forskellige sygdomstilstande ^9,10. Som stabile bærere af en uparret elektron, en tritylgruppe radikal tris (8-carboxy-2,2,6,6-tetra (hydroxyethyl) benzo- [1,2-4,5] bis- (1,3) -dithiole-4-yl) methyl-natriumsalt (OX063) eller (2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-1-yl) oxy (TEMPO) anvendes sædvanligvis. Disse blandes med den ønskede ^13C-mærkede molekyle og eksponeret for mikrobølgebestråling med en frekvens tæt på den tilsvarende EPR frekvens. Ved hjælp af denne teknik, kan polariseringen af ¹³ C kerner øges op til 37% ^11. Dette resulterer i en 10 ⁵ fold polarisering forbedring i forhold til den termiske ligevægt polarisering ^11,12. Men så snart mikrobølgebestråling standses og / eller ^13C-molekyle overføres til flydende tilstand, polarisationen henfalder med den langsgående relaksationstid _(T1) af ^13C kerne, blev polariseret. Såledesopfindelse af hurtige opløsningstider teknikker eller en senere teknik forkorte tiden før eksperimentel måling (dvs. injektion) er afgørende for biologiske anvendelser ^13.

Der er tre store krav, at kandidaten molekylet har brug for at opfylde for en vellykket ¹³ CMRSI undersøgelser. Første, ^13C kerne af interesse skal have en tilstrækkelig lang _T1 (> 10 s). Valget af ^13C-mærket er afgørende. Den bedste kandidat kerner er carbonatomer uden direkte kontakt med ^1H-kerner via en binding. Det skal også metaboliseres hurtigt inden 2 – 3 i T ₁ gange, hvilket resulterer i en nedstrøms metabolisk produkt med en signifikant forskellig kemisk skift fra det oprindelige stof. Blandingen Prøven skal også udgøre et amorft glas, når i en fast tilstand, således at den rumlige fordeling formindsker afstanden mellem elektronen og ^13C, således at transfer af polarisering. Hvis kandidatmolekylet ikke danner amorfe glas naturligt, det skal være letopløseligt i en glassing middel, såsom glycerol eller dimethylsulfoxid ^14. Disse krav medfører et relativt lille antal kandidatmolekyler. Men selv efter en vellykket opdagelsen af en egnet molekyle, udvikle en arbejdsgruppe protokol for hyperpolarisering kan være teknisk udfordrende ^9,14,15.

I de seneste år har adskillige substrater været succesfuldt polariseret, såsom [1- ^13C] pyruvat ^{12,16 – 36,} [2- ^13C] pyruvat ^37, [1- ^13C] ethylpyruvat ^38, [1- ^13C ] lactat ^39, [1- ^13C] fumarat ^{40 – 43 13C-bicarbonat 36,44,45,} [1- ^13C] natriumacetat ^{43,46 – 49, 13C-urea 6,36,50,51} , [5- ^13C] glutamine ^15,52,53, [1- ^13C] glutamat ^53,54, [1- ¹³ C] 2-oxoglutarat ^55, [1- ^13C] alanin og andre ^14,56. En særlig interessant og almindeligt anvendte substrat til hyperpolarisering er [1- ^13C] pyruvat. Det er almindeligt anvendt i prækliniske studier for at undersøge den cellulære energi-metabolisme i forskellige sygdomme ^14,17,22. [1- ¹³ C] pyruvat opfylder alle krav til en vellykket hyperpolarisering, herunder en forholdsvis lang T ₁ og hurtig transport over cellemembranen før senere at blive metaboliseret. Prækliniske studier med [1- ¹³ C] pyruvat øjeblikket oversat til klinikken ^57.

Metabolisme af pyruvat

Det er velkendt, at der er en direkte sammenhæng mellem mutationer i et kræftceller 'DNA og ændringer i deres metaboliske veje. Allerede i 1920'erne, Otto Warburg Discovob- at der er en øget metabolisme af glucose og produktion af lactat i tumorer sammenlignet med raske væv ^{58 – 60 år.} Efterfølgende forskellige vekslen i andre metaboliske veje, såsom pentose-phosphat pathway, tricarboxylsyrecyklen, oxidativ phosphorylering, og syntesen af ​​nukleotider og lipider, er blevet beskrevet.

Pyruvat er slutproduktet af glycolyse. I tumoren, det undergår anaerob glycolyse katalyseret af LDH ⁶¹ og reagerer med den reducerede form af coenzym nikotinamidadenindinukleotid (NADH), hvilket resulterer i lactat og den oxiderede form af coenzym (NAD ^+). Alternativt pyruvat undergår en transamineringsreaktion med glutamat til dannelse alanin, katalyseret af alanin transaminase (ALT). Begge reaktioner er let reversible. Pyruvat undergår også decarboxylering katalyseret af pyruvatdehydrogenase (PDH) til carbondioxid og acetyl-CoA, representing en irreversibel reaktion på dette trin. Vekslen i disse reaktionshastigheder kan knyttes til tumor stofskifte ^{17,21,22,25,62.} De metaboliske veje er opsummeret i figur 2.

Figur 2: Diagram over væsentligste metaboliske reaktion af pyruvat. Pyruvat / lactat omdannelse katalyseres af LDH, og pyruvat / alanin omdannelse katalyseres af ALT. Pyruvat omdannes irreversibelt til acetyl-CoA og CO ₂ ved PDH, og CO ₂ er i et pH-afhængig ligevægt med bicarbonat ^80. Klik her for at se en større version af dette tal.

Påvisningen af hyperpolariseret [1- ^13C] pyruvat og dets metabolitter er tidligere blevet påvist i rotter hanart ^{37,63 – 65,} lever ^66, muskel, og nyre ^62,67. En undersøgelse viste betydelige forskelle i lactat-til-alanin-forhold mellem den normale og fastede rottelever ⁶⁶ og demonstrerede en stærkt forhøjet og hyperpolariserede [1- ^13C] lactat niveau i leverkræft ^68,69. Der er beviser for, at tumoren klasse kan identificeres i en transgen adenocarcinom af mus prostata (TRAMP) ved hjælp af hyperpolariseret [1- ¹³ C] pyruvat ^22, med de hyperpolariserede laktatniveauer viser en høj korrelation med den histologiske kvalitet af de udskårne tumorer. Den alanin katalyseret fra pyruvat ved ALT er også blevet foreslået som en nyttig markør i rotte hepatocellulært carcinom ^23.

Måling af pyruvat-lactat metabolisk flux har været anvendt til overvågning iskæmi ^63,65,70 og som en reaktion på behandling med cytotoksisk kemoterapi ^17,40, målrettede lægemidler <sup> 24,25,41, eller radioterapi ²⁶ i dyremodeller. Det er også blevet anvendt til påvisning af phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) inhibitor LY294002 respons i glioblastom og brystcancer musemodeller ^25. Ændringer i pyruvat-metabolisme i hjernetumorer ²⁶ og prostatacancer ^24,71 er også blevet observeret efter behandling.

prostatacarcinom

Prostata karcinom er den dominerende kræft hos ældre mænd og den næsthyppigste kræft relateret til døden hos mænd verden over ^72. Til dato, ingen pålidelige, ikke-invasive metoder er tilgængelige for en tidlig diagnose og karakterisering af prostatakræft ^73,74, understreger det presserende behov for nye metaboliske billeddannende teknikker til at muliggøre stringent påvisning og iscenesættelse af patienterne. Prostatacarcinom blev anvendt som en model til at demonstrere mulighederne for opløsning DNP kombineret med ¹³ CMRSI i patients ^57. Dette arbejde blev fortsat i en første kliniske forsøg, der anvender [1- ^13C] pyruvat og ¹³ CMRSI til billeddannelse af prostatacancer, og det er netop er afsluttet (NCT01229618).

Motivationen bag dette arbejde var at illustrere mere detaljeret og for et bredere publikum anvendelsen af den ¹³ CMRSI metoden i et præklinisk indstilling med celler. Måling af LDH-katalyseret metabolisme af [1- ¹³ C] pyruvat til [1- ¹³ C] laktat in vitro i PC3 prostata karcinom cellelinje, viser vi den mulige anvendelse af opløsning DNP i in vitro-undersøgelser og tage fat på de afgørende skridt og udfordringer under eksperimenter.

Protocol

1. Prøve Stock Solution Forberedelse Tilføj gadoterate meglumin (GadM, 0,5 mol / l) til koncentreret [1- 13C] pyrodruesyre at give en endelig koncentration på 1-mmol / L GadM. Tilføj trityl radikal tris (8-carboxy-2,2,6,6-tetra (hydroxyethyl) benzo- [1,2-4,5] bis- (1,3) -dithiole-4-yl) – methyl-natriumsalt (OX063) til denne blanding til opnåelse af en slutkoncentration på 15 mmol / l. Vortex indtil fuldstændig opløsning. BEMÆRK: Denne stamopløsning forberedelse er designet til brug…

Representative Results

Resultaterne af "mikrobølge sweep" er illustreret i figur 3. Det viser, at den optimale mikrobølgefrekvens for [1- 13C] pyruvat prøve er på 94,156 GHz for den lokale 3.35-T hyperpolarisator. Alle følgende hyperpolarisering eksperiment (n = 14) blev udført under anvendelse denne mikrobølgefrekvens med en effekt på 100 mW. Den mikrobølgebestråling blev påført i 60 til 80 min, hvilket fører til en solid-state hyperpolarisering højere end 90%. Resultaterne er vist i <stron…

Discussion

¹³ CMRSI med hyperpolariserede prober er en lovende metode til at overvåge metabolisme i realtid in vitro og in vivo. Et meget vigtigt aspekt, når der anvendes denne eksperimentelle fremgangsmåde er den rigtige standardisering, især hvad angår in vitro eksperimenter. Først skal gøres korrekt og konsekvent at opnå den samme koncentration af hyperpolariseret materiale i hvert eksperiment fremstillingen af ​​prøven. Dette kræver en præcis vejning af både prøven for at …

Materials

HyperSense DNP Polariser	Oxford Instruments		3.35 T preclinical DNP hyperpolarizer
GE/Agilent MR901	GE Healthcare/Agilent Technologies		7 T preclinical MRI scanner, with small bore designed for experiments onrodent
Spinsolve Carbon	Magritek		1 T NMR spectrometer with permanent magnet
Deuterium Oxide	Sigma Aldrich	7789-20-0
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	7558-79-4
Sodium phosphate monbasic	Sigma Aldrich	7558-80-7
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	1310-73-2
Disodium edetate	Sigma Aldrich	6381-92-6
Pyruvic acid – 13C1	Cambridge Isotopes Laboratories	CLM-8077-1
Dotarem (0.5 mmol/L)	Guerbet		gadoterate meglumine
tris (8-carboxy-2,2,6,6-tetra-(hydroxyethyl)-benzo-[1,2–4,5]-bis-(1,3)-dithiole-4-yl)-methyl sodium salt (OX063)	GE Healthcare		trityl radical used as a sourse of free electron
PC3 cell line	ATCC	CRL1435
F-12K medium	ATCC	30-2004
Fetal Bovine Serum	ATCC	SCRR-30-2020
Trypsine-EDTA Solution, 1X	ATCC	30-2101
Sample plastic cup	Oxford Instruments
Trypan blue	Bio-Rad	145-0013-MSDS