hyperpolarized¹³ C Metabolsk Magnetic Resonance spektroskopi og avbildning

Summary

Dynamic nuclear polarization with subsequent sample dissolution has enabled real-time studies of metabolism in biological systems. Hyperpolarized [1-¹³C]pyruvate was used to study lactate dehydrogenase activity in a prostate carcinoma cell line in vitro.

Abstract

I de siste tiårene har nye metoder for svulst staging, restaging, behandlingsrespons overvåking, og tilbakefall deteksjon av en rekke kreftformer dukket opp i forbindelse med state-of-the-art positronemisjonstomografi med ¹⁸ F-fluorodeoxyglucose ^([18 F ] -FDG PET). ¹³ C magnetisk resonansavbildning spektroskopiske ⁽¹³ CMRSI) er en minimal invasiv avbildningsmetode som muliggjør overvåking av metabolisme in vivo og i sanntid. Som med en hvilken som helst annen metode basert på ^13C kjernemagnetisk resonans (NMR), står det utfordringen med lav termisk polarisering og en påfølgende lavt signal-til-støy-forhold på grunn av den relativt lave gyromagnetiske forhold på ¹³ C og dets lave naturlige overflod i biologiske prøver. Ved å overvinne disse begrensningene, har dynamisk atom polarisering (DNP) med påfølgende prøven oppløsning nylig aktivert brukte NMR og magnetisk resonans imaging (MRI) systemer for å måle, Studere og bilde viktige metabolske veier i ulike biologiske systemer. En spesielt interessant og lovende molekyl som brukes i ¹³ CMRSI er [1- ¹³ C] pyruvat, som i de siste ti årene, har vært mye brukt for in vitro, preklinisk, og nå nylig, kliniske studier for å undersøke den cellulære energiomsetningen i kreft og andre sykdommer. I denne artikkelen skissere vi teknikken for oppløsning DNP bruke en 3,35 T preklinisk DNP hyperpolarizer og demonstrere bruken i in vitro studier. En tilsvarende protokoll for hyperpolarization kan brukes for det meste i in vivo studier i tillegg. For å gjøre dette, anvendte vi laktatdehydrogenase (LDH) og katalyserte den metabolske reaksjon av [1- ^13C] pyruvat til [1- ^13C] laktat i en prostata carcinoma cellelinje, PC3, in vitro ved anvendelse av ¹³ CMRSI.

Introduction

For tiden er det mest brukte klinisk metode for tumor oppsetning, restaging, behandling respons overvåking, og gjentakelse påvisning av en rekke forskjellige krefttyper er ^[18F] -FDG PET. ¹ Men nylig, flere nye og alternative tilnærminger har dukket opp. En av disse metodene er ¹³ CMRSI. Denne teknikk innebærer innføring av det ¹³ C-molekyl i en biologisk prøve, etterfulgt av minimalt invasiv MR for å vurdere metabolisme in vitro eller in vivo i sanntid. Ikke desto mindre, det største utfordringen i ¹³ CMRSI, sammenlignet med andre metoder som for eksempel ^[18F] -FDG PET eller computertomografi, er dens lave signal-til-støy-forhold.

NMR-signalet er direkte proporsjonal med graden av polarisering, et forhold av spinn ½ kjerner populasjonsdifferanse i to energitilstander til den totale populasjonen (figur 1A). Polariseringen er et produkt av the gyromagnetiske forhold (γ) av kjernene, og det påførte magnetiske feltstyrken over temperatur. En typisk polarisering av ¹ H-kjerner er i størrelsesorden 0,001% til 0,005% etter 3 T, noe som gir en relativt dårlig signal-til-støy-forhold. Dagens state-of-the-art MR har vært en vellykket avbildningsmetode bare på grunn av den høye overflod av ^en H i biologiske prøver og den høye gyromagnetiske forholdet ¹ H (y _{1 H} = 42,576 MHz / T). Imidlertid observere andre kjerner, slik som karbon, er mer krevende. Den eneste stabile, magnetisk aktivt karbon isotop, ¹³ C, utgjør bare 1,1% av alle karbonatomer. I tillegg er det gyromagnetiske forholdet mellom ¹³ C (γ _13C = 10,705 MHz / T) fire ganger lavere enn for ^en H, som fører til en lavere deteksjonseffektivitet. Oppsummert, den lave ¹³ C overflod og lav γ _13C forårsake brann ¹³ C-målinger for å oppnå 0,0176% av følsomheten av en ¹H-NMR-måling in vivo.

Dynamisk Nuclear Polarisering

En fremgangsmåte for å overvinne den relativt dårlige følsomhet av ¹³ C-målinger er DNP. Det ble opprinnelig beskrevet for metaller i 1953 av Albert W. Hauser. I sin artikkel, uttalte han: «Det er vist at dersom elektronspinn resonans av lednings elektroner er mettet, vil kjernen bli polarisert i samme grad de ville være hvis deres gyromagnetiske forholdet var at av elektronspinn." ² Senere det året, Carver og Slichter eksperimentelt bekreftet Hauser hypotese ^3. I 1958 Abragam og Proctor beskrevet denne effekten for elektroner i væsker og kalte det for "solid effekt." Ved temperaturer under 4 K, når elektron-spinn polarisering nesten 100%, og er mer enn tre størrelsesordener høyere enn atom-spinn polarisering (figur 1B) ^4. Thans oppstår fordi det gyromagnetiske forholdet mellom elektronet (γ _e = 28024,944 MHz / T) er tre størrelsesordener høyere enn de nukleære gyromagnetiske forholdstall. De svake interaksjoner mellom elektroner og kjerner, slik som Overhauser-effekten, det faste stoff effekt, krysseffekten, og den termiske blandeeffekt, tillate overføring av polarisasjonen fra elektron-spinn til kjernespinn ved hjelp av mikrobølgestråling med en frekvens i nærheten av den tilsvarende elektron paramagnetisk resonans (EPR) frekvens ^5,6. DNP teorien har blitt videreutviklet for å involvere flere elektroner og termisk blanding. Likevel, til dags dato, ingen enhetlig kvantitativ teoretisk beskrivelse av DNP er publisert ^7,8.

Figur 1: Forstå Dynamic Nuclear Polarisering og hyperpolarisering. A) En skjematisk sammenligning av spinn populasjoneni termisk likevekt polarisasjonstilstand og den hyperpolariserte tilstand. B) Den polariseringen er avhengig av temperaturen. Polariseringen av et elektron (e ^-) når 100% under 1,4 K. DNP tillater overføring av polarisasjonen fra e- til de ¹³ C-kjernene, noe som øker deres polarisasjon inntil 10 ⁵ fold. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Å introdusere DNP i studier av biologiske systemer ved hjelp av ^13C, påfølgende rask sample oppløsning måtte utvikles. 50 år etter Hauser hypotese, Jan H. Ardenkjaer-Larsen et al. løst teknisk utfordrende problemet med å bringe den hyperpolariserte frosne prøve i flytende tilstand med minimalt tap hyperpolarisering ^6. Oppløsning DNP åpnet et nytt forskningsfelt som heter ¹³ pliktige CMR-stofferJeg, som gir en ny metode for å undersøke og karakterisere ulike sykdomstilstander ^9,10. Som stabile bærere av et uparet elektron, en trityl- radikal tris (8-karboksy-2,2,6,6-tetra (hydroksyetyl) -benzo- [1,2-4,5] -bis- (1,3) -dithiole-4-yl) -metyl-natriumsalt (OX063) eller (2,2,6,6-tetrametylpiperidin-1-yl) oksyl (TEMPO) blir vanligvis anvendt. Disse er blandet med den ønskede ¹³ C-merket molekyl og utsatt for mikrobølgestråling med en frekvens i nærheten av den tilsvarende EPR frekvens. Ved hjelp av denne teknikken, kan polarisasjonen av ¹³ C-kjerner økes opp til 37% ^11. Dette resulterer i en 10 ^5-doble polarisasjon forbedring sammenlignet med den termiske likevekt polarisasjonen ^11,12. Men så snart som den mikrobølgebestråling er stoppet og / eller den ¹³ C-molekylet er overført til flytende tilstand, avtar den polarisasjon med den langsgående relaksasjonstid (T ₁₎ av ^13C kjernen som ble polarisert. Dermed blirOppfinnelsen av raske oppløsnings teknikker eller eventuelle senere teknikk forkorte tiden før eksperimentell måling (dvs. injeksjon) er avgjørende for biologiske applikasjoner ^13.

Det er tre store krav at kandidaten molekylet trenger for å oppfylle for vellykkede ¹³ CMRSI studier. For det første har ¹³ C-kjernen av interesse å ha en tilstrekkelig lang T ₁ (> 10 s). Valget av det ¹³ C-etikett er avgjørende. Den beste kandidaten kjerner er karboner med ingen direkte kontakt med ¹ H-kjerner via en obligasjon. Det må også bli hurtig metabolisert i løpet av 2 – 3 T ₁ ganger, noe som resulterer i en nedstrøms metabolsk produkt med en vesentlig forskjellig kjemisk skift fra den opprinnelige substans. Prøveblandingen må også danne et amorft glass når den er i en fast tilstand, slik at den romlige fordelingen avtar avstanden mellom elektronet og ¹³ C, slik at det transfer av polarisering. Hvis kandidaten molekylet ikke danner amorft glass naturlig, må det være meget oppløselig i et glassing middel, slik som glycerol eller dimetylsulfoksyd ^14. Disse kravene fører til et forholdsvis lite antall kandidatmolekyler. Imidlertid, selv etter en vellykket oppdagelsen av en egnet molekyl, utvikle en arbeidsprotokoll for hyperpolarisering kan være teknisk utfordrende ^9,14,15.

I de senere årene har flere substrater vært vellykket polarisert, for eksempel [1- ^13C] pyruvat ^{12,16 – 36,} [2- ^13C] pyruvat ^37, [1- ^13C] etyl-pyruvat ^38, [1- ¹³ C ] laktat ^39, [1- ^13C] fumarat ^{40-43, 13} C-bikarbonat ^36,44,45, [1- ^13C] natriumacetat ^{43,46 – 49, 13C-urea 6,36,50,51} , [5- ¹³ C] glutamine ^15,52,53, [1- ^13C] glutamat ^53,54, [1- ¹³ C] 2-oksoglutarat ^55, [1- ^13C] alanin, og andre ^14,56. En spesielt interessant og som vanligvis brukes substrat for hyperpolarisering er [1- ^13C] pyruvat. Den er mye brukt i prekliniske studier for å undersøke den cellulære energiomsetningen i ulike sykdommer ^14,17,22. [1- ^13C] pyruvat oppfyller alle krav for vellykket hyperpolarisering, blant annet en forholdsvis lang T ₁ og rask transport over cellemembranen før senere blir metabolisert. Prekliniske studier med [1- ¹³ C] pyruvat blir nå oversatt til klinikken ^57.

Metabolisme av Pyruvate

Det er vel kjent at det er en direkte sammenheng mellom mutasjoner i en kreftcellenes DNA og endringer i deres metabolske veier. Allerede på 1920-tallet, Otto Warburg discovket at det er en økt metabolisme av glukose og produksjon av laktat i tumorer sammenlignet med friskt vev ^58-60. Deretter diverse alter på andre metabolske veier, slik som den pentose-fosfat svei, den trikarboksylsyre syklus, oksidativ fosforylering, og syntese av nukleotider og lipider, er blitt beskrevet.

Pyruvat er sluttproduktet av glykolyse. I tumoren, gjennomgår det anaerob glykolyse katalysert av LDH ⁶¹ og reagerer med den reduserte formen av nikotinamidadenindinukleotid koenzym (NADH), som resulterer i laktat og den oksyderte formen av koenzym (NAD ^+). Alternativt, gjennomgår pyruvat en trans reaksjon med glutamat for å danne alanin, katalysert av alanin transaminase (ALT). Begge reaksjoner er lett reversibel. Pyruvat også gjennomgår dekarboksylering katalysert av pyruvat dehydrogenase (PDH) til karbondioksyd og acetyl-CoA, representing en irreversibel reaksjon på dette trinnet. Alter i disse reaksjonshastigheter kan knyttes til tumor metabolisme ^{17,21,22,25,62.} De metabolske baner er oppsummert i figur 2.

Figur 2: Skisse av større metabolsk reaksjon av pyruvat. Pyruvat / laktat konvertering er katalysert av LDH, og pyruvat / alanin konvertering katalyseres av ALT. Pyruvat er irreversibelt omdannet til acetyl-CoA og CO _to av PDH, og CO ₂ er i et pH-avhengig likevekt med bikarbonat ^80. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Påvisningen av hyperpolariserte [1- ^13C] pyruvat og dets metabolitter er tidligere blitt påvist i rotte hanart ^{37,63 – 65,} lever ^66, muskler og nyrer ^62,67. En studie viste signifikante forskjeller i laktat-til-alanine forholdet mellom normal og fastet rottelever ⁶⁶ og demonstrert en svært forhøyet og hyperpolarized [1- ¹³ C] laktatnivå i leveren kreft ^68,69. Det er dokumentert at svulsten klasse kan identifiseres i en transgen adenokarsinom i mus prostata (TRAMP) med hyperpolarized [1- ¹³ C] pyruvat ^22, med Hyperpolariserte laktatnivåer som viser en høy korrelasjon med histologisk grad av skåret svulster. Den alanine katalysert fra pyruvat ved ALT har også blitt foreslått som en nyttig markør i rotteleverkreft ^23.

Måling av pyruvat-laktat metabolsk fluks har blitt brukt for å overvåke iskemi ^63,65,70 og som en respons på behandling med cytotoksisk kjemoterapi ^17,40, målrettede medikamenter <sup> 24,25,41 eller strålebehandling ²⁶ i dyremodeller. Det har også blitt brukt for påvisning av fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) inhibitor LY294002 reaksjon med glioblastom og brystkreft musemodeller ^25. Endringer i pyruvat stoffskiftet i hjernen tumorer ²⁶ og prostatakreft ^24,71 er også observert etter behandling.

prostata Carcinoma

Prostata kreft er den dominerende kreft hos eldre menn og den nest største kreft knyttet til død hos menn over hele verden ^72. Til dags dato ingen pålitelig, ikke-invasive metoder for tidlig diagnose og karakterisering av prostatakreft ^73,74, understreker det akutte behovet for nye metabolske bildeteknikker for å muliggjøre strenge deteksjon og iscenesettelse av pasienter. Prostata carcinoma ble anvendt som en modell for å demonstrere muligheten for oppløsnings DNP kombinert med ¹³ CMRSI i pasientenss ^57. Dette arbeidet ble videreført i en første klinisk studie ansette [1- ¹³ C] pyruvat og ¹³ CMRSI for avbildning av prostata kreft, og det har bare nylig har blitt fullført (NCT01229618).

Bakgrunnen for dette arbeidet var å illustrere mer detaljert og for et større publikum anvendelse av ¹³ CMRSI metoden i en preklinisk omgivelser med celler. Måling av LDH-katalysert metabolisme av [1- ^13C] pyruvat til [1- ^13C] laktat in vitro i PC3 prostata carcinoma-cellelinjen, viser at det er mulig anvendelse av oppløsnings DNP i in vitro studier, og ta opp de avgjørende skritt og utfordringer under eksperimentene.

Protocol

1. Prøve Stock Solution Forberedelse Legg gadoterate meglumin (GadM, 0,5 mol / l) for å konsentrert [1- 13C] pyrodruesyre til å gi en sluttkonsentrasjon på 1 mmol / l GadM. Legg trityl radikal tris (8-karboksy-2,2,6,6-tetra (hydroksyetyl) -benzo- [1,2-4,5] -bis- (1,3) -dithiole-4-yl) – metyl-natriumsalt (OX063) til denne blanding for å gi en sluttkonsentrasjon på 15 mmol / l. Vortex inntil fullstendig oppløsning. MERK: Denne stamløsningen preparatet er beregnet for bruk med en 3,35-T…

Representative Results

Resultatene av "mikrobølge sweep" er illustrert i figur 3. Den viser at den optimale mikrobølgefrekvens for [1- 13C] pyruvat prøven er ved 94,156 GHz for den lokale 3,35-T hyperpolarizer. Alle påfølgende hyperpolarisering eksperiment (n = 14) ble utført ved anvendelse av denne mikrobølgefrekvens med en effekt på 100 mW. Den mikrobølgebestråling ble påført i 60 til 80 min, noe som fører til en solid-state hyperpolarisering høyere enn 90%. Resultatene er presentert i <st…

Discussion

¹³ CMRSI med Hyperpolariserte prober er en lovende metode for å overvåke metabolisme i sann tid in vitro og in vivo. Ett meget viktig aspekt ved anvendelse av denne eksperimentelle fremgangsmåte er den riktige standardisering, spesielt når det gjelder in vitro-eksperimenter. Først må fremstillingen av prøven som skal gjøres riktig og konsekvent å oppnå samme konsentrasjon av hyperpolariserte materiale i hvert eksperiment. Dette krever en nøyaktig veiing av både prøven t…

Materials

HyperSense DNP Polariser	Oxford Instruments		3.35 T preclinical DNP hyperpolarizer
GE/Agilent MR901	GE Healthcare/Agilent Technologies		7 T preclinical MRI scanner, with small bore designed for experiments onrodent
Spinsolve Carbon	Magritek		1 T NMR spectrometer with permanent magnet
Deuterium Oxide	Sigma Aldrich	7789-20-0
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	7558-79-4
Sodium phosphate monbasic	Sigma Aldrich	7558-80-7
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	1310-73-2
Disodium edetate	Sigma Aldrich	6381-92-6
Pyruvic acid – 13C1	Cambridge Isotopes Laboratories	CLM-8077-1
Dotarem (0.5 mmol/L)	Guerbet		gadoterate meglumine
tris (8-carboxy-2,2,6,6-tetra-(hydroxyethyl)-benzo-[1,2–4,5]-bis-(1,3)-dithiole-4-yl)-methyl sodium salt (OX063)	GE Healthcare		trityl radical used as a sourse of free electron
PC3 cell line	ATCC	CRL1435
F-12K medium	ATCC	30-2004
Fetal Bovine Serum	ATCC	SCRR-30-2020
Trypsine-EDTA Solution, 1X	ATCC	30-2101
Sample plastic cup	Oxford Instruments
Trypan blue	Bio-Rad	145-0013-MSDS