Hyperpolarized¹³ ספקטרוסקופיה בתהודה מגנטית מטבולית C והדמיה

Summary

Dynamic nuclear polarization with subsequent sample dissolution has enabled real-time studies of metabolism in biological systems. Hyperpolarized [1-¹³C]pyruvate was used to study lactate dehydrogenase activity in a prostate carcinoma cell line in vitro.

Abstract

בעשורים האחרונים, שיטות חדשות עבור staging גידול, restaging, ניטור תגובה לטיפול, וזיהוי ישן בסוגים שונים של הסרטן צמחו בשיתוף עם המדינה- of-the-art טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים עם ¹⁸ F-fluorodeoxyglucose ^([18 F ] -FDG PET). ¹³ הדמיה ספקטרוסקופיות בתהודה מגנטית C ⁽¹³ CMRSI) היא שיטת דימות פולשנית המאפשרת ניטור של מטבוליזם in vivo ו בזמן אמת. כמו בכל שיטה אחרת המבוססת על ¹³ תהודה מגנטית גרעינית C (NMR), היא עומדת בפני האתגר של קיטוב תרמית נמוך יחס אות לרעש נמוך שלאחר מכן עקב יחס gyromagnetic הנמוך היחסי של ¹³ C והשפע הטבעי הנמוך שלה דגימות ביולוגיות. על ידי להתגבר על המגבלות האלה, קיטוב גרעיני דינמי (DNP) עם פירוק מדגם עוקב אפשר לאחרונה נפוץ תמ"ג תהודה מגנטית (MRI) מערכות למדידה, מחקר, מסלולים מרכזיים מטבולית תמונה במערכות ביולוגיות שונות. במיוחד מולקולה מעניינת ומבטיחה בשימוש ¹³ CMRSI היא [1- ¹³ C] פירובט, אשר, בעשר השנים האחרונות, כבר בשימוש נרחב עבור במבחנה, פרה-קליני, ולאחרונה, מחקרים קליניים לחקור את חילוף חומרי אנרגיה התאי בסרטן ומחלות אחרות. במאמר זה, נתאר את הטכניקה של DNP פירוק באמצעות hyperpolarizer DNP פרה-קליני 3.35 T ולהפגין השימוש שלה במבחנה. פרוטוקול דומה עבור hyperpolarization ניתן להחיל על פי רוב במחקרים vivo גם כן. לשם כך, השתמשנו לקטט דהידרוגנאז (LDH) ו catalyzed התגובה המטבולית של [1- ¹³ C] פירובט ל [1- ¹³ C] לקטט בקו תא סרטן הערמונית, PC3, במבחנה באמצעות ¹³ CMRSI.

Introduction

נכון להיום, השיטה הקלינית הנרחבת ביותר עבור staging גידול, restaging, ניטור תגובה לטיפול, וזיהוי הישנות של מגוון רחב של סוגי הסרטן הוא ^[18 F] -FDG PET. ¹ עם זאת, לאחרונה, מספר גישות חדשות ואלטרנטיביות צמחו. אחת השיטות הללו הוא ¹³ CMRSI. טכניקה זו כרוכה כניסתה של ¹³ C-מולקולת דגימה ביולוגית, ואחריו MRI פולשנית להעריך את חילוף החומרים במבחנה או in vivo בזמן אמת. עם זאת, האתגר הגדול ביותר של ¹³ CMRSI, לעומת שיטות אחרות כגון ^[18 F] -FDG PET או טומוגרפיה ממוחשבת, הוא יחס אות לרעש נמוך שלה.

אות התמ"ג עומדת ביחס ישר לרמת קיטוב, יחס של הבדל אוכלוסיית ספין ½ הגרעינים בשתי מדינות אנרגיה לכלל האוכלוסייה (איור 1 א). הקיטוב הוא מוצר של הדואר יחס gyromagnetic (γ) של הגרעינים ואת עוצמת השדה המגנטי מוחל על הטמפרטורה. קיטוב טיפוסי של ¹ גרעיני H הוא בסדר גודל של 0.001% 0.005% ב -3 T, אשר נותן עניים יחסית יחס אות לרעש. המדינה- of-the-art של היום MRI כבר שיטת הדמיה מוצלחת רק בשל השפע הגבוה של ¹ H ב דגימות ביולוגיות ויחס gyromagnetic הגבוה של ¹ H (γ _1H = 42.576 מגה-רץ / T). עם זאת, התבוננות גרעינים אחרים, כגון פחמן, הוא תובעני יותר. האיזוטופ פחמן יציב, רק פעיל מגנטית, ¹³ C, מהווה רק 1.1% מכלל אטומי פחמן. בנוסף, היחס gyromagnetic של ¹³ C (γ _13C = 10.705 מגה-הרץ / T) הוא ארבע פעמים נמוכה מזו של ¹ H, שמוביל איתור יעילות נמוכה. לסיכום, את השפע ¹³ C נמוך _13C γ נמוך לגרום תרמית ¹³ מדידות C להשיג 0.0176% של רגישות של ¹H-NMR מדידה in vivo.

קיטוב גרעיני דינמי

שיטה להתגבר על הרגישות העניה יחסית של ¹³ מדידות C היא DNP. זה תואר לראשונה על מתכות בשנת 1953 על ידי אלברט וו אוברהאווזר. במאמרו, הוא הצהיר: "זה מוצג שאם תהודת ספין אלקטרון של אלקטרוני ההולכה רוויה, הגרעינים יהיו מקוטבים באותה המידה שהם יהיו אם יחס gyromagnetic שלהם היה של ספין האלקטרון." ² מאוחר יותר באותה שנה, קארבר Slichter אישר ההשערה של אוברהאווזר ניסיוני ^3. בשנת 1958, Abragam ו פרוקטור תיאר את האפקט הזה עבור האלקטרונים נוזלים והפתרון זכה לשם "אפקט מוצק." בטמפרטורות מתחת ל -4 K, קיטוב האלקטרון-ספין מגיע כמעט 100% והוא יותר שלושה סדרי גודל גבוה יותר הקיטוב גרעיני-ספין (איור 1B) ^4. Tשלו מתרחש בגלל יחס gyromagnetic של האלקטרון _(ה γ = 28024.944 MHz / T) הוא שלושה סדרי גודל גבוה מיחסי gyromagnetic הגרעיניים. האינטראקציות החלשות בין אלקטרונים וגרעינים, כגון אפקט אוברהאווזר, ההשפעה המוצקה, השפעת הצלב, וכן השפעת ערבוב התרמית, לאפשר העברת קיטוב מן אלקטרון ספינים כדי ספינים גרעיניים באמצעות הקרנת מיקרוגל עם תדר קרוב האלקטרון המקביל ^5,6 תדר התהודה פאראמגנטיים (EPR). התיאוריה DNP פותחה נוספת לערב יותר אלקטרונים ערבוב תרמית. אף על פי כן, עד כה, שום תיאור תיאורטי כמותית אחידה של DNP פורסם ^7,8.

איור 1: הבנה דינמית גרעיני קיטוב hyperpolarization. א) השוואה סכמטי של אוכלוסיית הספיןבמדינת קיטוב שיווי משקל תרמי ומדינת hyperpolarized. ב) הקיטוב תלוי בטמפרטורה. הקיטוב של אלקטרון (ה ^-) מגיע ל -100% מתחת 1.4 ק DNP מאפשרת העברה של הקיטוב מן אי-מייל ¹³ הגרעינים C, אשר מגדילה את הקיטוב שלהם עד 10 ⁵ -fold. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

כדי להציג DNP במחקרים של מערכות ביולוגיות באמצעות ¹³ C תמ"ג, פירוק מדגם מהיר שלאחר מכן היה צריך להיות מפותח. 50 שנים אחרי ההשערה של אוברהאווזר, Jan H. Ardenkjaer-לארסן ואח. פתר את הבעיה מאתגר מבחינה טכנית של הבאת מדגם קפוא hyperpolarized למצב נוזלי עם הפסד ⁶ hyperpolarization מינימלי. DNP פירוק נפתח תחום חדש של מחקר שנקרא ¹³ CMRSאני, מתן שיטה חדשה לחקור ולאפיין מצב מחלה שונה ^9,10. כנישאים יציבים של אלקטרון מזווג, טריס רדיקלי trityl (8-carboxy-2,2,6,6-אַרְבַּע- (hydroxyethyl) -benzo- [1,2-4,5] -bis- (1,3) -dithiole-4-י.ל.) מלח נתרן -methyl (OX063) או (2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-1-י.ל) oxyl (TEMPO) משמש בדרך כלל. אלה מעורבבים עם מולקולת C שכותרתו ¹³ הרצוי חשוף קרינת מיקרוגל עם תדר קרוב לתדר EPR המקביל. באמצעות טכניקה זו, הקיטוב של ¹³ גרעינים C ניתן להגדיל עד 37% ^11. התוצאה הוא שיפור קיטוב 10 ⁵ -fold לעומת קיטוב שיווי משקל תרמי ^11,12. עם זאת, ברגע הקרנת המיקרוגל נעצר ו / או ¹³ C-המולקולה מועברת במצב הנוזלי, הקיטוב דועך עם זמן ההרפיה האורך (T ₁₎ של ¹³ גרעין C כי היה מקוטב. לפיכך,המצאת טכניקות פירוק מהירות או כל טכניקה עוקבת קיצור הזמן לפני מדידה ניסיונית (כלומר, הזרקה) הוא חיוני עבור יישומים ביולוגיים ^13.

ישנן שלוש דרישות מרכזיות כי מולקולת המועמד צריכה למלא עבור ¹³ מחקרים CMRSI מוצלחים. ראשית, גרעין ¹³ C של עניין צריך להיות ₁ T מספיק ארוך (> 10 שניות). הבחירה של ¹³ C-התווית הוא קריטי. גרעיני המועמד הטובים ביותר הם פחמנים ללא מגע ישיר עם ¹ H-גרעינים באמצעות אג"ח. זה גם צריך להיות מטבוליזם במהירות תוך 2 – 3 פעמים T _1, וכתוצאה מכך מוצר מטבולית המשך בעלי שינוי כימי שונה באופן מהותי מן החומר המקורי. תערובת המדגם חייבת גם מהווה זכוכית אמורפי כאשר במצב מוצק כל כך כי הפריסה המרחבית מקטינה את המרחק בין האלקטרון ו ^-13 C, המאפשרת טרנסfer של קיטוב. אם מולקולת המועמד אינה יוצרת זכוכית אמורפית טבעית, זה צריך להיות מסיס מאוד סוכן glassing, כגון sulfoxide גליצרול או דימתיל ^14. דרישות אלה לגרום למספר קטן יחסית של מולקולות מועמד. עם זאת, גם לאחר הגילוי המוצלח של מולקולה מתאימה, פיתוח פרוטוקול עבודה עבור hyperpolarization יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית ^9,14,15.

בשנים האחרונות, כמה מצעים כבר מקוטב בהצלחה, כגון [1 ¹³ C] פירובט ^{12,16 – 36,} [2 ¹³ C] פירובט ^37, [1 ¹³ C] פירובט אתיל ^38, [1 ¹³ C ] לקטט ^39, [1 ¹³ C] fumarate ^{40 – 43, 13} C-ביקרבונט ^36,44,45, [1 ¹³ C] נתרן אצטט ^{43,46 – 49, 13} C-אוריאה ^6,36,50,51 , [5 ¹³ C] glutamine ^15,52,53, [1 ¹³ C] גלוטמט ^53,54, [1 ¹³ C] 2-oxoglutarate ^55, [1 ¹³ C] אלאנין, ואחרים ^14,56. מצע מעניין במיוחד ונהוגים עבור hyperpolarization הוא [1- ¹³ C] פירובט. זה נעשה שימוש נרחב במחקרים פרה לחקור את האנרגיה חילוף החומרים התאי במחלות שונות ^14,17,22. [1 ¹³ C] פירובט עומד בכל הדרישות עבור hyperpolarization מוצלחת, כולל תחבורה יחסית הארוך T ₁ ומהיר על פני קרום התא לפני ובהמשך להיות מפורק. מחקרים פרה עם [1- ¹³ C] פירובט מתורגמים כרגע למרפאה ^57.

מטבוליזם של פירובט

העובדה ידועה היא כי קיים קשר ישיר בין מוטציות DNA של תאים סרטניים ושינויי מסלולי מטבוליים שלהם. כבר בשנת 1920, אוטו ורבורג וגילהered שיש מטבוליזם של גלוקוז ייצור מוגבר של חומצת חלב בגידולים בהשוואה לרקמות בריאות ^{58 – 60.} בהמשך לכך, החילופים שונים מסלולים מטבוליים אחרים, כגון מסלול פנטוז-פוספט, מחזור חומצה tricarboxylic, זרחון חמצוני, ואת סינתזה של נוקלאוטידים ושומנים, תוארו.

פירובט הוא התוצר הסופי של הגליקוליזה. בתוך הגידול, הוא עובר הגליקוליזה אנאירובי מזורזת על ידי LDH ⁶¹ ומגיב עם הצורה המצומצמת של dinucleotide אדנין nicotinamide קואנזים (NADH), וכתוצאה מכך לקטט ואת טופס החמצון של קואנזים (NAD ^+). לחלופין, פירובט עובר תגובת transamination עם הגלוטמט לגבש אלאנין, מזורזת על ידי אלאנין טראנסאמינאז (ALT). תגובות שניהם הפיכות בקלות. פירובט גם עובר decarboxylation מזורזת על ידי פירובט דהידרוגנאז (PDH) פחמן דו חמצני אצטיל-CoA, representing תגובה בלתי הפיכה בשלב זה. חילופים בשיעורי תגובה אלה ניתן לקשר מטבוליזם גידול ^{17,21,22,25,62.} מסלולים מטבוליים מסוכמים באיור 2.

איור 2: תרשים של התגובה המטבולית הגדולה של פירובט. מרת פירובט / לקטט מזורזת על ידי LDH, ו פירובט / מרת אלאנין מזורזת על ידי ALT. פירובט מומר באופן בלתי הפיך כדי אצטיל-CoA ו- CO ₂ על ידי PDH, ו- CO ₂ הם בשיווי משקל pH התלוי עם ⁸⁰ ביקרבונט. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

הגילוי של hyperpolarized [1- ¹³ C] פירובט מטבוליטים שלו כבר הוכיח בעבר בחולדה הואאמנות ^{37,63 – 65,} כבד ^66, שריר, וכליות ^62,67. מחקר אחד הדגים הבדלים משמעותיים ביחס לקטט-אל-אלאנין בין חולדה הכבד נורמלי צם ⁶⁶ והפגינו רמה [1- ¹³ C] מוגבה hyperpolarized מאוד לקטט סרטן הכבד ^68,69. ישנן ראיות כי בכיתת הגידול ניתן לזהות בתוך אדנוקרצינומה מהונדס של ערמונית עכבר (נווד) באמצעות hyperpolarized [1- ¹³ C] פירובט ^22, עם רמות חומצת חלב hyperpolarized מראות מתאם גבוה עם הכיתה היסטולוגית של בגידולים. אלאנין זרז מן פירובט ידי ALT גם הוצע כסמן שימושי קרצינומה hepatocellular עכברוש ^23.

מדידת השטף מטבולית-לקטט פירובט שימש במשך איסכמיה ניטור ^63,65,70 וכתגובה לטיפול בכימותרפיה ציטוטוקסית ^17,40, תרופות ממוקדות <sup> 24,25,41, או רדיותרפיה ²⁶ במודלים של בעלי חיים. כמו כן נעשה שימוש לצורך זיהוי של התגובה LY294002 מעכב 3-kinase phosphatidylinositol (PI3K) במודלים של עכברים גליובלסטומה וסרטן השד ^25. שינויים במטבוליזם פירובט במוח גידולים ²⁶ וסרטן הערמונית ^24,71 גם נצפו לאחר הטיפול.

הערמונית קרצינומה

קרצינומה של הערמונית הוא הסרטן משתלט בגברים קשישים הסרטן המובילה השנייה הקשורים למוות בקרב גברים ברחבי העולם ^72. עד כה, אף אחת משיטות אמינות, לא פולשנית זמינות עבור אבחון מוקדם ואפיון של סרטן הערמונית ^73,74, תוך שימת דגש על הצורך הדחוף טכניקות הדמית מטבולית רומן מאפשר זיהוי מחמירים ובימוי של חולים. קרצינומה הערמונית שימש כמודל כדי להדגים את האפשרויות של DNP פירוק בשילוב עם ¹³ CMRSI בחולהזה ^57. עבודה זו נמשכה ניסוי קליני ראשון העסקה [1- ¹³ C] pyruvate ו ^-13 CMRSI עבור ההדמיה של סרטן הערמונית, והוא רק לאחרונה הושלם (NCT01229618).

המניע מאחורי המחקר הנוכחי היה להמחיש באופן מפורט יותר עבור קהל רחב יותר ביישום של ¹³ שיטת CMRSI באווירה פרה-קלינית עם תאים. מדידת חילוף חומרי LDH-זרז של [1- ¹³ C] פירובט כדי [1- ¹³ C] לקטט במבחנת הקו הסלולרי קרצינומה PC3 הערמונית, אנחנו מדגימים את היישום האפשרי של DNP פירוק במבחנה ב ולטפל בצעדים מכריעים אתגרים במהלך הניסויים.

Protocol

1. הכנת מדגם פתרון במלאי להוסיף meglumine gadoterate (GadM, 0.5 mol / L) כדי מרוכז [1- 13 C] פירובט לתת ריכוז סופי של 1-mmol / L GadM. להוסיף trityl טריס הרדיקלי (8-carboxy-2,2,6,6-אַרְבַּע- (hydroxyethyl) -benzo- [1,2-4,5] -bis- (1,3) -dithiole-4-י.ל.) – מלח נתרן מהתיל (OX063) לתערוב?…

Representative Results

התוצאות של "לטאטא מיקרוגל" הם באיור 3. זה מראה כי תדירות המיקרוגל האופטימלית למדגם [1- 13 C] פירובט היא 94.156 GHz עבור hyperpolarizer 3.35-T המקומי. כל ניסוי hyperpolarization הבא (n = 14) בוצע באמצעות תדר מיקרוגל זה עם כוח של 100 mW. הקרנת המיקרוגל יושמה במשך 60 עד 80 דקות, מה שמוביל …

Discussion

¹³ CMRSI עם בדיקות hyperpolarized היא שיטה מבטיחה לפקח חילוף החומרים בזמן אמת במבחנה in vivo. היבט אחד חשוב מאוד כאשר המעסיקים תהליך הניסוי הזה הוא סטנדרטיזציה ראויה, במיוחד לגבי בניסויים במבחנה. ראשית, הכנת המדגם צריך להיעשות כראוי בעקביות להשגת ריכוז זהה של ?…

Materials

HyperSense DNP Polariser	Oxford Instruments		3.35 T preclinical DNP hyperpolarizer
GE/Agilent MR901	GE Healthcare/Agilent Technologies		7 T preclinical MRI scanner, with small bore designed for experiments onrodent
Spinsolve Carbon	Magritek		1 T NMR spectrometer with permanent magnet
Deuterium Oxide	Sigma Aldrich	7789-20-0
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	7558-79-4
Sodium phosphate monbasic	Sigma Aldrich	7558-80-7
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	1310-73-2
Disodium edetate	Sigma Aldrich	6381-92-6
Pyruvic acid – 13C1	Cambridge Isotopes Laboratories	CLM-8077-1
Dotarem (0.5 mmol/L)	Guerbet		gadoterate meglumine
tris (8-carboxy-2,2,6,6-tetra-(hydroxyethyl)-benzo-[1,2–4,5]-bis-(1,3)-dithiole-4-yl)-methyl sodium salt (OX063)	GE Healthcare		trityl radical used as a sourse of free electron
PC3 cell line	ATCC	CRL1435
F-12K medium	ATCC	30-2004
Fetal Bovine Serum	ATCC	SCRR-30-2020
Trypsine-EDTA Solution, 1X	ATCC	30-2101
Sample plastic cup	Oxford Instruments
Trypan blue	Bio-Rad	145-0013-MSDS