형광 상관 분광학에 의해 측정 된 차 림프구의 플라즈마 막 분자 확산
Summary
A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.
Abstract
형광 상관 분광법 (FCS)은 높은 시공간 해상도 생체막 내 분자의 확산을 연구하는 강력한 기술이다. FCS는 세포막에서 형광 표지 된 분자의 분자 확산 계수 및 농도를 정량화 할 수있다. 이 기술은 (실제 측정 시간 동안의 결과에 영향을 미치는 일없이, IE) 정상 상태가 면역 세포의 세포막 분자의 분자 확산 특성을 조사하는 기능을 갖는다. FCS는 대부분의 내인성 단백질의 전형적인 수준으로 발현되는 단백질의 확산을 연구하는데 적합하다. 여기서, 차 림프구의 세포막 단백질의 확산 속도를 결정하기위한 간단하고 강력한 방법이 설명된다. 항체 염색 생균 및 수집 한 후 통상적으로 발생 관측에 대한 측정을 수행하는 효과적인 방법을 설명한다. 최근 발전광 안정 형광 염료의 개발에 광범위 측정 동안 표백하지 염료 적절한 관심 항체 컨쥬 게이트가 이용 될 수있다. 또한이 세포막에 발현 된 단백질의 공통 특징이다 천천히 확산 엔티티의 검출을 허용한다. 생성 된 자기 상관 곡선에서 분자 농도와 확산 매개 변수를 추출하는 분석 절차가 강조 표시됩니다. 요약하면, FCS 측정을위한 기본 프로토콜이 제공된다; 그것은 공 초점 현미경의 이해되지만, 분자 확산 속도와 같은 동적 매개 변수를 측정하기위한 기술의 다른 이전의 경험과 면역 학자 다음에 할 수 있습니다.
Introduction
많은 면역 세포의 기능을 분자 확산과 세포막 내에서의 상호 작용에 의존한다. 생체막들은 복잡하고, 세포막 단백질의 하나에서 병진 확산 속도에 영향을 미칠 수있는 면역 세포의 기능에 중요 할 수있는 많은 요소. 최근 선천성 면역계에 속하는 자연 살해 (NK) 세포, 림프구, NK 세포 활성화 (2)의 상태에 따라 세포막 단백질 두 연구의 차동 확산을 나타내는 것으로 나타났다.
형광 상관 분광법 (FCS)는 생체막 내의 분자 확산 속도를 정량화 할 수있는 기술이다. 그것은의 찬란 고정 볼륨 분자 표지의 평균 확산 속도, 공 초점 현미경의 일반적으로 초점을보고합니다. 그것은 분자 운동에 따라 발생하는 형광의 변동의 측정에 기초정상 상태에서의 시스템. FCS 널리 용액과 지질막 내에 두 형광 염료 및 단백질의 확산을 연구에 사용되었다. 확산 속도에 영향을 미치는 다른 출력 매개 변수는 또한 간접적 방식으로 조사 할 수있다 (예를 들어, 단백질이나 세포막의 분자의 상호 작용의 구조적 변화) (3, 4). FCS는 단일 분자 검출에 대한 가능성을 허용하는 높은 민감도로 인해, 다른 방법에 비하여 우수하다. 그것은 대부분의 단백질 5의 내생 발현 수준에 대한 전형적인 밀리몰 범위로 나노 몰, 분자의 농도에 적합합니다. 다른 대부분의 기술들은 단지 단백질 발현 수준에 대한 상대적 정보를 제공하면서 또한, FCS는 연구 볼륨 내의 단백질의 절대 값의 근사치를 제공 할 수있다. 막은 FLUO 포함 내의 다른 방법은 분자의 확산 속도를 측정(FRAP)을 photobleaching에 후 rescence 복구, 단일 입자 추적 (SPT), 다수의 핀홀 FCS 및 이미지의 상관 관계 방법. FRAP 및 이미지의 상관 관계 방법은 일반적으로 분자 (10)의 절대 수에 대한 정보를 제공하지 않는 앙상블 기법이다. SPT에 비해, FCS의 처리량은 모집단 평균의 특성에 관해서 높다. 레이저 초점 내에 존재하는 분자의 평균 확산 속도가 아니라 단일 분자의 속도보다, 측정 이후 분석은 덜 요구된다. 전문 현미경 (11)을 사용할 수 있습니다하지 않는 한 표준 SPT 라벨은 단일 분자의 식별을 허용하는 것은 매우 낮아야 때문에, SPT는 농도에 대한 정보를 제공 할 수 없습니다. 한편, FCS는 연구중인 분자가 이동되어야합니다. 그것은 단순히 매우 느리게 이동하는 추정 움직이지 분수 또는 분자를 감지하지 않습니다. 분자의 확산 속도 즉긴 획득 시간의 약 1/10 FCS 정확하게 측정 (3) (12)에 표시되지 않을 것보다 초점 내에 상주. 따라서, FCS에 의해 기록 된 확산 계수는에-움직이지-가까운 매우 느린 분수는뿐만 아니라 고려 FRAP와 SPT, 같은 기술에서보고 된 확산 속도보다 빠른 경향이있다. SPT는 것보다 FCS 분자 집단 내에서의 확산 률의 변동에 대한 상세한 설명을 제공 할 것이다.
FCS는 흥분 볼륨 내의 시간에 따른 형광 강도의 변동을 정량화한다. 멤브레인의 측정의 경우, 이는 멤브레인의 조명 영역으로 변환한다. 이 논문은 이러한 변동 브라운 확산을 나타내는 분자에 의해 유도되고, 따라서, 및 여진 부피 밖으로 이동된다는 사실을 이용한다. fluctua에 대한 몇 가지 다른 가능한 소스가있다이러한 바인딩 바인딩 해제 전체 세포막의 리간드, 또는 이동의 점멸 또는 형광, 환경 영향의 삼중 상태의 존재와 형광 신호 TIONS. 이러한 추정 에러 소스는 정확한 결과 (12, 13)을 해석하기 위하여 FCS 내의 실험을 설계 할 때 고려 될 필요가있다. 일반적으로 생물 세포막의 측면 확산 속도는 막 단백질 사이 단백질과 세포 골격 사이에 모두 밀집과의 상호 작용에 의한 낮다. 역사적으로, 멤브레인의 FCS의 사용, 따라서 여기 포커스 (14)를 통해 연장 된 전이 시간 동안 탈색을 방지하기 위해 필요한 광 안정 형광체의 부족에 의해 방해되어왔다. 그러나 오늘, 적합한 사진 안정 염료에 대한 많은 옵션이 있습니다. 감지기 및 기타 하드웨어 크게 향상 또한 형광 보호 자전거의 검출을 허용기능과 낮은 밝기의 염료. 여기서, 항체 태그 관심 단백질은 형광 물질로 표지되어 뮤린 차 림프구를 사용하여 FCS의 응용 프로그램을위한 기본 프로토콜이 설명된다. 확산 계수는 분자 밀도를 추출하기 위해 자기 상관 곡선 맞도록 접근법은 또한 도시되어있다. 프로토콜은 쉽게 분자의 확산을 연구하는 기술 된 이전의 경험 면역학 다음되는 것을 목적으로한다. 그러나, 공 초점 현미경의 기본 이해가 예상된다 (참조 (15) 참조 기본적인 이해를 위해). 이 프로토콜은 비교적 용이 다른 현탁 세포 세포주 및 일차 전지 모두 적용될 수있다. 숙련 된 FCS 사용자를 위해 더 정제 된 분석 방법 중 일부는 논의에 기술되어 존재한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
FCS이 프로토콜은 면역 세포 (뮤린, 인간 또는 다른 종) 모든 유형의 표면 분자의 분자 동력학 평가를 위해 사용될 수있다. 아래 살아있는 세포의 단일 분자 해상도 FCS 조치 시공간 분자 역학. 분자 밀도뿐만 아니라, 관심있는 단백질의 확산 속도 및 클러스터링 역학은 자기 상관 곡선으로부터 추출 될 수있다.
형광 라벨에 성공 FCS 실험에 대한 중요한 중요하다. 세포막에 관심?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 자이스 Confocor 3 장비의 유지 보수 및 셀 측정에 관한 유용한 팁 박사 Vladana Vukojeviç, 분자 의학 센터, 카롤린스카 연구소 감사합니다. 이 연구는, 매그너스 Bergvalls stiftelse 및 Stiftelsen Claes가 Groschinskys의 minnesfond에서 Vetenskapsrådet에서 보조금 (1629 허가 번호 2012-)에 의해 투자되었다.
Materials
| MACS NK Cell Isolation Kit mouse II | Miltenyi Biotec NordenAB | 130-096-892 | Negative selection of NK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Adlrich | F7524 | Heat inactivated |
| Phosphate Buffered Saline | – | – | Made in house |
| Roswell Park Memorial Institute medium 1640 | PAA The Cell Culture Company | E15-848 | Transparent medium |
| Antibody clone 2.4G2 | Thermo Fischer Scientific | 553140 | For blocking Fc-receptors. |
| Anti-Ly49A antibody | Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647 | ||
| Clone JR9.318 | |||
| Anti-H-2Dd antibody | BD Pharmingen | 558915 | Conjugated in house to MFP488 |
| Clone 34.5.8S | |||
| MFP488 | Mobiotech | MFP-A2181 | Fluorescent dye for antibody conjugation. |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Diluted in distilled water (1.10) |
| Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa) | SuSoS AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) | Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml. |
| Rhodamine 110 chloride | Sigma-Aldrich | 432202 | Known diffusion coefficient: 3.3 × 10−10 m2/s 19 |
| Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A20006 | Known diffusion coefficient: 4.4 × 10−10 m2/s 20 |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM510 | |
| Software: Confocor 3 | Zeiss | ||
| Software: Matlab with curve fitting toolbox | Matlab | Version R2013b | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo-scientific | 155411 | 8 wells, 1.0 borosilicate bottom |
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