Moleculaire Diffusion in de plasmamembraan van Primary lymfocyten gemeten met behulp van fluorescentie Correlatie Spectroscopie
Summary
A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.
Abstract
Fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS) is een krachtige techniek voor het bestuderen van diffusie van moleculen in biologische membranen met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. FCS kan de moleculaire concentratie en diffusiecoëfficiënt van fluorescent gelabelde moleculen te kwantificeren in het celmembraan. Deze techniek heeft het vermogen om de moleculaire diffusie eigenschappen van moleculen in het plasmamembraan van immuuncellen in normaal staand (dus zonder processen die het resultaat tijdens het werkelijke meettijd). FCS is geschikt voor het bestuderen van de diffusie van eiwitten die tot expressie op niveaus kenmerkend voor de meeste endogene eiwitten. Hier, wordt een eenvoudige en robuuste methode om de diffusiesnelheid van celmembraaneiwitten op primaire lymfocyten bepalen aangetoond. Een effectieve manier om metingen aan antilichaam-gekleurde levende cellen en veel voorkomende waarnemingen na de overname uitvoeren, worden beschreven. De recente ontwikkelingenin de ontwikkeling van stabiele foto-fluorescerende kleurstoffen kunnen worden gebruikt door het conjugeren van het antilichamen van belang kleurstoffen die niet uitgebreid hebben bleken tijdens de metingen bestemmen. Bovendien maakt dit de detectie van langzaam diffunderende entiteiten die een gemeenschappelijk kenmerk eiwitten aanwezig in celmembranen. De analyse procedure om de concentratie en verspreiding parameters moleculaire extraheren uit de gegenereerde autocorrelatie bochten is gemarkeerd. Samengevat wordt een basisprotocol FCS metingen ontvangen; Het zal door immunologen met verstand van confocale microscopie doch zonder andere ervaring van technieken voor het meten van de dynamische parameters, zoals moleculaire diffusiesnelheid.
Introduction
Veel immuuncellen functies afhankelijk moleculaire diffusie en interacties binnen membranen. Biologische membranen zijn complex en vele factoren die belangrijk zijn voor de functie van immune cellen kan de snelheid van translationele diffusie van eiwitten beïnvloeden binnen celmembranen 1 kan zijn. We hebben onlangs aangetoond dat natuurlijke killer (NK) cellen, lymfocyten behoren tot het aangeboren immuunsysteem vertonen differentiële diffusie van twee onderzochte eiwitten op de celmembraan afhankelijk van de toestand van NK-celactivering 2.
Fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS) is een techniek die in staat kwantificeren moleculaire diffusiesnelheid in biologische membranen. Rapporteert de gemiddelde diffusiesnelheid van fluorescent gelabelde moleculen in een vast volume, meestal de focus van een confocale microscoop. Het is gebaseerd op de meting van de fluctuaties in fluorescentie die optreden bij moleculaire beweging ineen systeem in stabiele toestand. FCS is op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van de diffusie van fluorescerende kleurstoffen en proteïnen, zowel in oplossing als in lipide membranen. Andere uitvoerparameters die de diffusiesnelheid kan ook indirect worden bestudeerd op deze manier (bijvoorbeeld conformationele veranderingen in eiwitten of interacties van moleculen over celmembranen) 3, 4. FCS onderscheidt zich in vergelijking met andere technieken vanwege de hoge gevoeligheid, waardoor de mogelijkheid van één molecuul detectie. Het werkt goed voor moleculaire concentraties in het nanomolair tot millimolair bereik, die typisch is voor endogene expressieniveaus van de meeste eiwitten 5. Bovendien kan FCS een benadering van het absolute aantal eiwitten in de bestudeerde volume te geven, terwijl de meeste andere technieken alleen relatieve informatie over eiwit expressie levels geven. Andere methoden om moleculaire diffusie tarieven te meten binnen membranen omvatten fluocerend herstel na fotobleken (FRAP), enkel deeltje tracking (SPT), meervoudige pinhole FCS en beeldcorrelatie methoden. FRAP en beeldcorrelatie methoden zijn ensemble technieken, die over het algemeen geen informatie over het absolute aantal moleculen 10 te geven. Vergeleken met SPT, de doorvoer van FCS hoger met betrekking tot karakterisering van de gemiddelde bevolking. De analyse is ook minder veeleisend aangezien de gemiddelde diffusiesnelheid van de aanwezigheid in het laserfocus moleculen wordt gemeten in plaats van de snelheid van enkele moleculen. Ook, tenzij gespecialiseerde microscopen zijn verkrijgbaar 11, SPT kan geen informatie over de concentratie te geven, omdat standaard SPT etikettering zeer laag mogelijk te maken voor de identificatie van enkele moleculen moet zijn. Anderzijds, FCS vereist de moleculen onder studie mobiel. Het zal gewoon niet vermeende immobiele fracties of moleculen bewegen heel langzaam op te sporen. De diffusiesnelheid van moleculen dieverblijf op de focus langer dan ongeveer een tiende van de overname tijd zal niet correct worden weergegeven in FCS metingen 3, 12. Daarom diffusiecoëfficiënten opgenomen door FCS meestal sneller dan diffusiesnelheden gerapporteerd door technieken zoals FRAP en SPT, waarbij de nagenoeg in immobiele en zeer traag fracties rekening mee gehouden worden. SPT zal ook een meer gedetailleerde beschrijving van de variabiliteit van de diffusie-tarieven binnen de moleculaire bevolking dan FCS wil.
FCS kwantificeert de fluctuatie van fluorescentie-intensiteit in de tijd binnen de opgewonden volume. Bij membraan metingen, vertaalt het verlichte oppervlak van het membraan. In deze paper, maken we gebruik van het feit dat dergelijke fluctuaties worden veroorzaakt door moleculen vertonen Brownse diffusie en zijn dus bewegen in en uit de excitatie volume. Er zijn ook verschillende andere mogelijke bronnen voor de schommelingenties in het fluorescentiesignaal, zoals knipperen of de aanwezigheid van een triplet toestand in de fluoroforen, milieueffecten binding-ontbinding van ligand, of beweging van het gehele celmembraan. Deze vermeende foutbronnen rekening moet worden gehouden bij het ontwerpen van een FCS experiment om de resultaten 12, 13 te interpreteren. Typisch, laterale diffusie tarieven in biologische membranen zijn laag als gevolg van verdringing en interacties, zowel tussen membraaneiwitten en tussen eiwitten en het cytoskelet. Historisch gezien is de toepassing van FCS in membranen is dus belemmerd door het gebrek aan foto-stabiele fluoroforen, die nodig zijn om het bleken tijdens de verlengde looptijden door het excitatie brandpunt 14 te voorkomen. Echter, vandaag, zijn er tal van mogelijkheden voor geschikte foto-stabiele kleurstoffen. Significante verbeteringen in detectoren en andere hardware ook toestaan dat de detectie van fluorescerende proteins en kleurstoffen van lagere helderheid. Hier, een basisprotocol voor de toepassing van FCS met knaagdiermodellen primaire lymfocyten, waarbij het eiwit van belang wordt gemerkt met een fluorescent gelabeld antilichaam, beschreven. Een benadering van de autocorrelatie krommen teneinde de diffusiecoëfficiënt en de moleculaire dichtheid extraheren passen wordt ook getoond. Het protocol is gericht op het wordt gemakkelijk gevolgd door immunologen zonder eerdere ervaring van technieken om de verspreiding van moleculen te bestuderen. Er is echter een basiskennis van confocale microscopie verwacht (om deze basiskennis te krijgen, zie referentie 15). Dit protocol kan betrekkelijk gemakkelijk worden aangepast aan andere suspensiecellen, beide cellijnen en primaire cellen. Voor gevorderde gebruikers FCS, meer verfijnde analyse methoden bestaan, waarvan sommige worden beschreven in de bespreking.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol FCS kan worden gebruikt voor de beoordeling van de moleculaire dynamica van oppervlaktemoleculen op alle soorten immuuncellen (muizen, mensen of andere soorten). FCS maatregelen tijdruimtelijke moleculaire dynamica omlaag naar single-molecule resolutie in levende cellen. De moleculaire dichtheid, evenals de diffusiesnelheid en clustering dynamiek van de eiwitten van belang, kan worden gewonnen uit de autocorrelatie krommen.
De fluorescerende labeling is van cruciaal belang voor …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. Vladana Vukojević, Center for Molecular Medicine, Karolinska Institutet voor het onderhoud van de Zeiss Confocor 3 instrument en handige tips met betrekking tot mobiele metingen. Deze studie werd gefinancierd door subsidies van Vetenskapsrådet (subsidie nummer 2012- 1629), Magnus Bergvalls Stiftelse, en vanuit Stiftelsen Claes Groschinskys minnesfond.
Materials
| MACS NK Cell Isolation Kit mouse II | Miltenyi Biotec NordenAB | 130-096-892 | Negative selection of NK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Adlrich | F7524 | Heat inactivated |
| Phosphate Buffered Saline | – | – | Made in house |
| Roswell Park Memorial Institute medium 1640 | PAA The Cell Culture Company | E15-848 | Transparent medium |
| Antibody clone 2.4G2 | Thermo Fischer Scientific | 553140 | For blocking Fc-receptors. |
| Anti-Ly49A antibody | Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647 | ||
| Clone JR9.318 | |||
| Anti-H-2Dd antibody | BD Pharmingen | 558915 | Conjugated in house to MFP488 |
| Clone 34.5.8S | |||
| MFP488 | Mobiotech | MFP-A2181 | Fluorescent dye for antibody conjugation. |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Diluted in distilled water (1.10) |
| Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa) | SuSoS AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) | Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml. |
| Rhodamine 110 chloride | Sigma-Aldrich | 432202 | Known diffusion coefficient: 3.3 × 10−10 m2/s 19 |
| Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A20006 | Known diffusion coefficient: 4.4 × 10−10 m2/s 20 |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM510 | |
| Software: Confocor 3 | Zeiss | ||
| Software: Matlab with curve fitting toolbox | Matlab | Version R2013b | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo-scientific | 155411 | 8 wells, 1.0 borosilicate bottom |
References
- Goni, F. M. The basic structure and dynamics of cell membranes: an update of the Singer-Nicolson model. Biochim Biophys Acta. 1838, 1467-1476 (2014).
- Bagawath-Singh, S., et al. Cytokines Induce Faster Membrane Diffusion of MHC Class I and the Ly49A Receptor in a Subpopulation of Natural Killer Cells. Front Immunol. 7, (2016).
- Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy for the study of membrane dynamics and protein/lipid interactions. Methods. 46, 116-122 (2008).
- Machan, R., Wohland, T. Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems. FEBS Lett. 588, 3571-3584 (2014).
- Mutze, J., Ohrt, T., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in vivo. Laser Photon Rev. 5, 52-67 (2011).
- Lidke, D. S., Wilson, B. S. Caught in the act: quantifying protein behaviour in living cells. Trends Cell Biol. 19, 566-574 (2009).
- Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights. Rep Prog Phys. 78, 124601 (2015).
- Wiseman, P. W. Image correlation spectroscopy: principles and applications. Cold Spring Harb Protoc. , 336-348 (2015).
- Sankaran, J., Shi, X., Ho, L. Y., Stelzer, E. H., Wohland, T. ImFCS: a software for imaging FCS data analysis and visualization. Opt Express. 18, 25468-25481 (2010).
- Liu, P., Ahmed, S., Wohland, T. The F-techniques: advances in receptor protein studies. Trends Endocrinol Metab. 19, 181-190 (2008).
- Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 5, 155-157 (2008).
- Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications. Cold Spring Harb Protoc. , 709-725 (2014).
- Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 36, 151-169 (2007).
- Widengren, J., Thyberg, P. FCS cell surface measurements–photophysical limitations and consequences on molecular ensembles with heterogenic mobilities. Cytometry A. 68, 101-112 (2005).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172, 9-18 (2006).
- Meinhardt, K., et al. Influence of NK cell magnetic bead isolation methods on phenotype and function of murine NK cells. J Immunol Methods. 378, 1-10 (2012).
- Bacia, K., Schwille, P. Practical guidelines for dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nat Protoc. 2, 2842-2856 (2007).
- Gendron, P. O., Avaltroni, F., Wilkinson, K. J. Diffusion coefficients of several rhodamine derivatives as determined by pulsed field gradient-nuclear magnetic resonance and fluorescence correlation spectroscopy. J Fluoresc. 18, 1093-1101 (2008).
- Petrasek, Z., Schwille, P. Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy. Biophys J. 94, 1437-1448 (2008).
- Stromqvist, J., et al. A modified FCCS procedure applied to Ly49A-MHC class I cis-interaction studies in cell membranes. Biophys J. 101, 1257-1269 (2011).
- Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. Fluorescence Correlation Spectroscopy of Triplet-States in Solution – a Theoretical and Experimental-Study. J Phys Chem. 99, 13368-13379 (1995).
- Humpolickova, J., et al. Probing diffusion laws within cellular membranes by Z-scan fluorescence correlation spectroscopy. Biophys J. 91, L23-L25 (2006).
- Guo, S. M., et al. Bayesian approach to the analysis of fluorescence correlation spectroscopy data II: application to simulated and in vitro data. Anal Chem. 84, 3880-3888 (2012).
- Ries, J., et al. Automated suppression of sample-related artifacts in Fluorescence Correlation Spectroscopy. Opt Express. 18, 11073-11082 (2010).
- Chiu, C. L., et al. Intracellular kinetics of the androgen receptor shown by multimodal Image Correlation Spectroscopy (mICS). Sci Rep. 6, 22435 (2016).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Sci Rep. 6, 27290 (2016).
