Diffusion moléculaire Membranes plasmatiques de Lymphocytes primaires mesurées par Fluorescence Correlation Spectroscopy
Summary
A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.
Abstract
spectroscopie de fluorescence de corrélation (FCS) est une technique puissante pour étudier la diffusion des molécules dans les membranes biologiques avec une résolution spatiale et temporelle. FCS peut quantifier la concentration et le coefficient de diffusion moléculaire des molécules marquées par fluorescence dans la membrane cellulaire. Cette technique a la capacité d'explorer les caractéristiques de diffusion moléculaire de molécules dans la membrane plasmique des cellules immunitaires à l' état d' équilibre (ie, sans processus affectant le résultat pendant la durée de la mesure réelle). FCS est adapté à l'étude de la diffusion des protéines qui sont exprimées à des niveaux typiques pour la plupart des protéines endogènes. Ici, un procédé simple et robuste pour déterminer le taux de protéines de la membrane cellulaire sur les lymphocytes primaires de diffusion est démontrée. Un moyen efficace d'effectuer des mesures sur des cellules vivantes d'anticorps tachés et observations qui se produisent souvent après acquisition sont décrits. Les récents progrèsdans le développement des colorants fluorescents photo-stable peut être utilisé en conjugant les anticorps d'intérêt pour les colorants appropriés qui ne sont pas largement décolorent lors de la mesure. En outre, cela permet la détection d'entités à diffusion lente, ce qui est une caractéristique commune des protéines exprimées dans les membranes cellulaires. La procédure d'analyse pour extraire des paramètres de concentration et de diffusion moléculaire à partir des courbes d'auto-corrélation générée est mise en évidence. En résumé, un protocole de base pour la mesure FCS est fourni; elle peut être suivie par des immunologistes avec une compréhension de la microscopie confocale, mais sans autre expérience préalable des techniques de mesure des paramètres dynamiques, tels que les taux de diffusion moléculaire.
Introduction
De nombreuses fonctions des cellules immunitaires reposent sur la diffusion et les interactions au sein des membranes moléculaire. Les membranes biologiques sont complexes et nombreux facteurs qui peuvent être importants pour la fonction des cellules immunitaires peuvent influencer la vitesse de diffusion translationnelle des protéines dans les membranes cellulaires 1. Nous avons récemment montré que tueuses naturelles (cellules NK), les lymphocytes appartenant au système immunitaire inné, présentent la diffusion différentielle de deux protéines étudiées à la membrane cellulaire en fonction de l'état de l' activation des cellules NK 2.
La spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) est une technique qui est capable de quantifier les vitesses de diffusion moléculaire dans les membranes biologiques. Il rend compte de la vitesse de diffusion moyenne de molécules marquées par fluorescence dans un volume fixe, généralement l'objet d'un microscope confocal. Elle est basée sur la mesure des fluctuations de fluorescence qui se produit lors d'un mouvement moléculaireun système dans l'état d'équilibre. FCS a été largement utilisé pour l'étude de la diffusion des colorants et des protéines fluorescentes, à la fois en solution et dans des membranes lipidiques. D' autres paramètres de sortie qui affectent la vitesse de diffusion peuvent également être étudiés indirectement de cette manière (par exemple, des changements de conformation des protéines ou des interactions des molécules sur les membranes cellulaires) 3, 4. FCS se distingue par rapport aux autres techniques en raison de sa haute sensibilité, ce qui permet la possibilité pour la détection de molécule unique. Cela fonctionne bien pour les concentrations moléculaires dans la gamme nanomolaire à millimolaire, ce qui est typique pour des niveaux d'expression endogènes de la plupart des protéines 5. En outre, FCS peut donner une approximation du nombre absolu de protéines dans le volume étudié, alors que la plupart des autres techniques donnent seulement des informations relatives au sujet des niveaux d'expression de protéine. D'autres méthodes pour mesurer les taux de diffusion moléculaire dans les membranes comprennent fluorécupération rescence après photoblanchiment (FRAP), seul le suivi des particules (SPT), multiple sténopé FCS, et l'image de corrélation méthodes. Méthodes de FRAP et de l' image de corrélation sont des techniques d' ensemble, qui généralement ne donnent pas d' informations sur le nombre absolu de molécules 10. Par rapport à SPT, le débit de FCS est plus élevé en ce qui concerne la caractérisation de la moyenne de la population. L'analyse est moins exigeant étant donné que la vitesse de diffusion moyenne des molécules présentes à l'intérieur de la focalisation du laser est mesurée, plutôt que le taux de molécules uniques. Aussi, à moins que des microscopes spécialisés sont disponibles 11, SPT ne peut donner aucune information sur les concentrations, puisque l' étiquetage SPT standard doit être très faible pour permettre l'identification de molécules simples. D'autre part, FCS exige que les molécules à l'étude pour être mobile. Il sera tout simplement pas détecter d'éventuelles fractions ou molécules immobiles putatifs se déplaçant très lentement. Le taux de molécules de diffusion quirésider dans le foyer plus longtemps que d' environ un dixième du temps d'acquisition ne sera pas correctement représentée dans les mesures de FCS 3, 12. Par conséquent, les coefficients de diffusion enregistrés par FCS ont tendance à être plus rapide que les vitesses de diffusion signalés par des techniques comme FRAP et SPT, où les fractions proches à immobile et très lents sont pris en compte. SPT donnera également une description plus détaillée de la variabilité des taux de diffusion au sein de la population moléculaire que FCS sera.
FCS quantifie la fluctuation d'intensité de fluorescence au fil du temps dans le volume excité. Dans le cas des mesures de la membrane, cela se traduit par la zone éclairée de la membrane. Dans cet article, nous utilisons le fait que de telles fluctuations sont induites par des molécules présentant la diffusion brownienne et se déplacent donc dans et hors du volume d'excitation. Il y a aussi plusieurs autres sources possibles pour la fluctuations du signal de fluorescence, comme clignotant ou la présence d'un état de triplet dans les fluorophores, des effets sur l'environnement, la liaison-déliaison du ligand, ou le déplacement de la membrane de la cellule entière. Ces sources d'erreur putatifs doivent être prises en considération lors de la conception d' une expérience FCS afin d'interpréter correctement les résultats 12, 13. En règle générale, les taux de diffusion latérale dans les membranes biologiques sont faibles en raison de l'encombrement et des interactions entre les deux protéines de membrane et entre les protéines et le cytosquelette. Historiquement, l'utilisation de FCS dans les membranes a ainsi été entravée par le manque de fluorophores photo-stable, qui sont nécessaires pour éviter le blanchiment pendant les temps de transit prolongés à travers la mise au point d'excitation 14. Cependant, aujourd'hui, il y a beaucoup d'options pour les colorants photo-stables appropriés. Des améliorations significatives dans les détecteurs et autres matériels permettent également la détection de prote fluorescentins et colorants de luminosité plus faible. Ici, un protocole de base pour l'application du FCS à l'aide de lymphocytes primaires murins, où la protéine d'intérêt est marqué avec un anticorps étiqueté par fluorescence, est décrite. Une approche pour adapter les courbes d'autocorrélation afin d'en extraire le coefficient de diffusion et la densité moléculaire est également représentée. Le protocole vise à être facilement suivie par immunologistes sans expérience préalable des techniques pour étudier la diffusion des molécules. Cependant, une compréhension de base de la microscopie confocale devrait (d'acquérir cette connaissance de base, voir la référence 15). Ce protocole peut assez facilement être adapté à d'autres cellules en suspension, les deux lignées cellulaires et des cellules primaires. Pour les utilisateurs plus expérimentés FCS, des méthodes d'analyse plus raffinées existent, dont certains sont décrits dans la discussion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole a pour FCS peut être utilisé pour l'évaluation de la dynamique moléculaire des molécules de surface sur tous les types de cellules immunitaires (murins, humains ou d'autres espèces). Mesures FCS dynamique moléculaire spatio-temporelles vers le bas à la résolution une seule molécule dans les cellules vivantes. La densité moléculaire, ainsi que la vitesse de diffusion et de regroupement dynamique des protéines d'intérêt, peuvent être extraits à partir des courbes d'auto-corré…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Vladana Vukojevic, Centre de médecine moléculaire, Karolinska Institutet pour l'entretien de l'instrument Zeiss ConfoCor 3 et pour obtenir des conseils utiles concernant les mesures de cellules. Cette étude a été financée par des subventions de Vetenskapsrådet (numéro de subvention 2012- 1629), Magnus Bergvalls Stiftelse et de Stiftelsen Claes Groschinskys minnesfond.
Materials
| MACS NK Cell Isolation Kit mouse II | Miltenyi Biotec NordenAB | 130-096-892 | Negative selection of NK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Adlrich | F7524 | Heat inactivated |
| Phosphate Buffered Saline | – | – | Made in house |
| Roswell Park Memorial Institute medium 1640 | PAA The Cell Culture Company | E15-848 | Transparent medium |
| Antibody clone 2.4G2 | Thermo Fischer Scientific | 553140 | For blocking Fc-receptors. |
| Anti-Ly49A antibody | Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647 | ||
| Clone JR9.318 | |||
| Anti-H-2Dd antibody | BD Pharmingen | 558915 | Conjugated in house to MFP488 |
| Clone 34.5.8S | |||
| MFP488 | Mobiotech | MFP-A2181 | Fluorescent dye for antibody conjugation. |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Diluted in distilled water (1.10) |
| Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa) | SuSoS AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) | Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml. |
| Rhodamine 110 chloride | Sigma-Aldrich | 432202 | Known diffusion coefficient: 3.3 × 10−10 m2/s 19 |
| Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A20006 | Known diffusion coefficient: 4.4 × 10−10 m2/s 20 |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM510 | |
| Software: Confocor 3 | Zeiss | ||
| Software: Matlab with curve fitting toolbox | Matlab | Version R2013b | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo-scientific | 155411 | 8 wells, 1.0 borosilicate bottom |
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