إنتشار الجزيئي في أغشية البلازما الخلايا اللمفاوية الابتدائية تقاس الإسفار الارتباط الطيفي
Summary
A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.
Abstract
مضان الارتباط الطيفي (FCS) هي تقنية قوية لدراسة انتشار الجزيئات داخل الأغشية البيولوجية مع القرار المكانية والزمانية عالية. FCS يمكن قياس الجزيئي تركيز ومعامل الانتشار من جزيئات fluorescently المسمى في غشاء الخلية. هذه التقنية لديها القدرة على استكشاف خصائص الانتشار الجزيئي للجزيئات في الغشاء البلازمي للخلايا المناعية في حالة مستقرة (أي بدون العمليات التي تؤثر على نتيجة خلال فترة القياس الفعلي). FCS مناسبة لدراسة نشر من البروتينات التي يتم التعبير عنها على مستويات نموذجية للبروتينات الأكثر الذاتية. هنا، ويتجلى طريقة واضحة وقوية لتحديد معدل انتشار للبروتينات غشاء الخلية في الخلايا الليمفاوية الأولية. ووصف وسيلة فعالة لإجراء قياسات على خلايا حية ملطخة الأجسام المضادة والملاحظات التي تحدث عادة بعد الاستحواذ. التطورات الأخيرةفي تطوير الأصباغ الفلورية-صور ثابتة يمكن استخدامها من قبل التصريف الأجسام المضادة التي تهم الأصباغ التي لا التبييض على نطاق واسع خلال القياسات المناسبة. بالإضافة إلى ذلك، وهذا يسمح للكشف عن الكيانات نشرها ببطء، وهي سمة مشتركة من البروتينات التي أعرب عنها في أغشية الخلايا. وسلط الضوء على إجراء تحليل لاستخراج المعلمات التركيز ونشر الجزيئية من منحنيات الارتباط الذاتي التي تم إنشاؤها. وباختصار، يقدم البروتوكول الأساسي لقياس FCS. ويمكن أن يتبعه المناعة مع فهم متحد البؤر المجهري ولكن مع عدم وجود خبرة سابقة أخرى من تقنيات لقياس معلمات الحيوية، مثل معدلات انتشار الجزيئية.
Introduction
العديد من وظائف الخلايا المناعية تعتمد على الانتشار الجزيئي والتفاعلات داخل الأغشية. الأغشية البيولوجية المعقدة، والعديد من العوامل التي قد تكون مهمة لوظيفة الخلايا المناعية يمكن التأثير على سرعة نشر متعدية من البروتينات داخل الأغشية الخلوية 1. وأظهرت لنا مؤخرا أن القاتلة الطبيعية (NK) الخلايا، الخلايا الليمفاوية التابعة للنظام المناعة الفطري، تظهر نشر فرق من اثنين من البروتينات درس في غشاء الخلية تبعا للحالة NK تنشيط الخلايا 2.
مضان الارتباط الطيفي (FCS) هو تقنية قادرة على قياس معدلات انتشار الجزيئية داخل الأغشية البيولوجية. فإنه تقارير متوسط معدل الانتشار وصفت من fluorescently الجزيئات في حجم ثابت، وعادة محور المجهر متحد البؤر. لأنه يقوم على قياس التقلبات في مضان التي تحدث على الحركة الجزيئية فينظام في حالة مستقرة. وقد استخدم على نطاق واسع السفح لدراسة نشر الأصباغ الفلورية والبروتينات، سواء في حل وداخل الأغشية الدهنية. ويمكن أيضا معلمات الإخراج الأخرى التي تؤثر على معدل انتشار دراستها بشكل غير مباشر في هذا الشكل (على سبيل المثال، والتغيرات متعلق بتكوين بروتينات أو تفاعلات الجزيئات على أغشية الخلايا) 3، 4. FCS تبرز مقارنة مع التقنيات الأخرى نظرا لحساسيته العالية، مما يتيح إمكانية الكشف عن جزيء واحد. أنه يعمل بشكل جيد لتركيزات الجزيئية في nanomolar إلى مجموعة millimolar، الذي هو الحال بالنسبة للمستويات التعبير الذاتية لمعظم البروتينات 5. وعلاوة على ذلك، يمكن FCS إعطاء رقم تقريبي لعدد المطلق من البروتينات داخل حجم درس، في حين أن معظم تقنيات أخرى تعطي إلا معلومات النسبية حول مستويات بروتين تعبير. طرق أخرى لقياس معدلات انتشار الجزيئية ضمن تشمل الأغشية فلووانتعاش rescence بعد photobleaching من (FRAP)، جسيم واحد تتبع (SPT)، متعددة الثقب FCS، وارتباط صورة الأساليب. FRAP وارتباط صورة الأساليب هي أساليب المجموعات، والتي عادة لا تعطي معلومات حول العدد المطلق للجزيئات 10. مقارنة SPT، مرت من FCS أعلى فيما يتعلق تميز المتوسط السكان. التحليل هو أيضا أقل تطلبا منذ يقاس معدل انتشار الجزيئات الموجودة داخل التركيز الليزر، بدلا من نسبة الجزيئات واحدة. أيضا، إلا إذا المجاهر المتخصصة المتاحة 11، SPT لا يمكن إعطاء أي معلومات عن تركيزات، منذ معيار العلامات الفرعية يجب أن تكون منخفضة جدا للسماح للتعرف على الجزيئات واحدة. من ناحية أخرى، FCS يتطلب الجزيئات قيد الدراسة لتكون متنقلة. انها ببساطة لن يكشف عن أي كسور أو جزيئات متحركة المفترضة تتحرك ببطء شديد. معدل انتشار الجزيئات التييقيمون في التركيز أطول من أن ما يقرب من عشر اكتساب الوقت لا تكون ممثلة بشكل صحيح في القياسات FCS 3، 12. وبالتالي، معاملات نشر سجلتها FCS تميل إلى أن تكون أسرع من معدلات انتشار ذكرت من التقنيات مثل FRAP والفرعية، حيث يتم أخذ الكسور وثيقة لمتحرك وبطيئة جدا في الاعتبار كذلك. سوف SPT أيضا إعطاء وصفا أكثر تفصيلا من تباين معدلات الانتشار بين السكان الجزيئي من FCS سوف.
FCS الكمي تذبذب كثافة مضان مع مرور الوقت في حجم متحمس. في حالة قياسات غشاء، وهذا يترجم إلى منطقة مضيئة من الغشاء. في هذه الورقة، ونحن الاستفادة من حقيقة أن مثل هذه التقلبات تكون ناتجة عن جزيئات العارضة نشر البراونية، وبالتالي فهي تتحرك في والخروج من حجم الإثارة. هناك أيضا العديد من مصادر أخرى محتملة للfluctuaستعقد في إشارة مضان، مثل امض أو وجود حالة الثلاثي في fluorophores، والآثار البيئية، ملزم غير ملزم ليجند، أو حركة غشاء الخلية بأكملها. يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار عند تصميم تجربة FCS من أجل تفسير النتائج بدقة 12، 13 هذه المصادر خطأ المفترضة. عادة، ومعدلات الانتشار الأفقي في الأغشية البيولوجية منخفضة بسبب الازدحام والتفاعلات، سواء بين بروتينات الغشاء وبين البروتينات والهيكل الخلوي. تاريخيا، وبالتالي أعاق استخدام FCS في الأغشية بسبب عدم وجود fluorophores-صور ثابتة، وهي مطلوبة لتجنب التبييض خلال أوقات العبور طويلة من خلال التركيز الإثارة 14. ولكن اليوم، هناك الكثير من الخيارات لالأصباغ صورة مستقرة مناسبة. تحسينات كبيرة في الكشف عن والأجهزة الأخرى تسمح أيضا للكشف عن المتواجد الفلورسنتخصوصيات والأصباغ انخفاض السطوع. هنا، وبروتوكول الأساسية لتطبيق FCS باستخدام الخلايا الليمفاوية الأولية الفئران، حيث يتم وضع علامة على البروتين من الفائدة مع الموسومة fluorescently الأجسام المضادة، وصفت. ويرد أيضا نهجا لتناسب منحنيات الارتباط الذاتي من أجل استخراج معامل الانتشار والكثافة الجزيئية. ويهدف البروتوكول على أن يتبع بسهولة عن طريق المناعة مع عدم وجود خبرة سابقة من التقنيات لدراسة انتشار الجزيئات. ومع ذلك، من المتوقع فهم أساسي من الفحص المجهري متحد البؤر (للحصول على هذا الفهم الأساسي، أنظر المرجع 15). يمكن بسهولة نسبيا أن تتكيف هذا البروتوكول لخلايا تعليق الأخرى، سواء خطوط الخلايا والخلايا الأولية. لمزيد من المستخدمين FCS ذوي الخبرة، وأساليب تحليل أكثر دقة موجودة، وصفها البعض منها في المناقشة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول لFCS يمكن استخدامها لتقييم ديناميات الجزيئية لجزيئات على سطح كل أنواع من الخلايا المناعية (الفئران والبشرية، أو الأنواع الأخرى). تدابير FCS الجزيئية ديناميات المكانية والزمانية وصولا الى قرار جزيء واحد في الخلايا الحية. كثافة الجزيئية، فضلا عن معدل الا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور Vladana Vukojeviç، مركز الطب الجزيئي، معهد كارولينسكا للصيانة وثيقة زايس Confocor 3 و للحصول على نصائح مفيدة بشأن القياسات الخلية. وقد تم تمويل هذه الدراسة من المنح المقدمة من Vetenskapsrådet (منحة رقم 2012- 1629)، ماغنوس Bergvalls stiftelse، ومن STIFTELSEN كلايس Groschinskys minnesfond.
Materials
| MACS NK Cell Isolation Kit mouse II | Miltenyi Biotec NordenAB | 130-096-892 | Negative selection of NK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Adlrich | F7524 | Heat inactivated |
| Phosphate Buffered Saline | – | – | Made in house |
| Roswell Park Memorial Institute medium 1640 | PAA The Cell Culture Company | E15-848 | Transparent medium |
| Antibody clone 2.4G2 | Thermo Fischer Scientific | 553140 | For blocking Fc-receptors. |
| Anti-Ly49A antibody | Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647 | ||
| Clone JR9.318 | |||
| Anti-H-2Dd antibody | BD Pharmingen | 558915 | Conjugated in house to MFP488 |
| Clone 34.5.8S | |||
| MFP488 | Mobiotech | MFP-A2181 | Fluorescent dye for antibody conjugation. |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Diluted in distilled water (1.10) |
| Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa) | SuSoS AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) | Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml. |
| Rhodamine 110 chloride | Sigma-Aldrich | 432202 | Known diffusion coefficient: 3.3 × 10−10 m2/s 19 |
| Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A20006 | Known diffusion coefficient: 4.4 × 10−10 m2/s 20 |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM510 | |
| Software: Confocor 3 | Zeiss | ||
| Software: Matlab with curve fitting toolbox | Matlab | Version R2013b | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo-scientific | 155411 | 8 wells, 1.0 borosilicate bottom |
References
- Goni, F. M. The basic structure and dynamics of cell membranes: an update of the Singer-Nicolson model. Biochim Biophys Acta. 1838, 1467-1476 (2014).
- Bagawath-Singh, S., et al. Cytokines Induce Faster Membrane Diffusion of MHC Class I and the Ly49A Receptor in a Subpopulation of Natural Killer Cells. Front Immunol. 7, (2016).
- Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy for the study of membrane dynamics and protein/lipid interactions. Methods. 46, 116-122 (2008).
- Machan, R., Wohland, T. Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems. FEBS Lett. 588, 3571-3584 (2014).
- Mutze, J., Ohrt, T., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in vivo. Laser Photon Rev. 5, 52-67 (2011).
- Lidke, D. S., Wilson, B. S. Caught in the act: quantifying protein behaviour in living cells. Trends Cell Biol. 19, 566-574 (2009).
- Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights. Rep Prog Phys. 78, 124601 (2015).
- Wiseman, P. W. Image correlation spectroscopy: principles and applications. Cold Spring Harb Protoc. , 336-348 (2015).
- Sankaran, J., Shi, X., Ho, L. Y., Stelzer, E. H., Wohland, T. ImFCS: a software for imaging FCS data analysis and visualization. Opt Express. 18, 25468-25481 (2010).
- Liu, P., Ahmed, S., Wohland, T. The F-techniques: advances in receptor protein studies. Trends Endocrinol Metab. 19, 181-190 (2008).
- Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 5, 155-157 (2008).
- Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications. Cold Spring Harb Protoc. , 709-725 (2014).
- Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 36, 151-169 (2007).
- Widengren, J., Thyberg, P. FCS cell surface measurements–photophysical limitations and consequences on molecular ensembles with heterogenic mobilities. Cytometry A. 68, 101-112 (2005).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172, 9-18 (2006).
- Meinhardt, K., et al. Influence of NK cell magnetic bead isolation methods on phenotype and function of murine NK cells. J Immunol Methods. 378, 1-10 (2012).
- Bacia, K., Schwille, P. Practical guidelines for dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nat Protoc. 2, 2842-2856 (2007).
- Gendron, P. O., Avaltroni, F., Wilkinson, K. J. Diffusion coefficients of several rhodamine derivatives as determined by pulsed field gradient-nuclear magnetic resonance and fluorescence correlation spectroscopy. J Fluoresc. 18, 1093-1101 (2008).
- Petrasek, Z., Schwille, P. Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy. Biophys J. 94, 1437-1448 (2008).
- Stromqvist, J., et al. A modified FCCS procedure applied to Ly49A-MHC class I cis-interaction studies in cell membranes. Biophys J. 101, 1257-1269 (2011).
- Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. Fluorescence Correlation Spectroscopy of Triplet-States in Solution – a Theoretical and Experimental-Study. J Phys Chem. 99, 13368-13379 (1995).
- Humpolickova, J., et al. Probing diffusion laws within cellular membranes by Z-scan fluorescence correlation spectroscopy. Biophys J. 91, L23-L25 (2006).
- Guo, S. M., et al. Bayesian approach to the analysis of fluorescence correlation spectroscopy data II: application to simulated and in vitro data. Anal Chem. 84, 3880-3888 (2012).
- Ries, J., et al. Automated suppression of sample-related artifacts in Fluorescence Correlation Spectroscopy. Opt Express. 18, 11073-11082 (2010).
- Chiu, C. L., et al. Intracellular kinetics of the androgen receptor shown by multimodal Image Correlation Spectroscopy (mICS). Sci Rep. 6, 22435 (2016).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Sci Rep. 6, 27290 (2016).
