Difusão molecular em membranas plasmáticas de linfócitos primários medida por fluorescência Correlation Spectroscopy

Summary

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

Abstract

espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS) é uma técnica poderosa para o estudo da difusão de moléculas dentro de membranas biológicas com elevada resolução espacial e temporal. FCS pode quantificar a concentração e coeficiente de difusão molecular de moléculas marcadas fluorescentemente na membrana da célula. Esta técnica tem a capacidade de explorar as características de difusão molecular de moléculas na membrana plasmática de células do sistema imunológico em estado estacionário (isto é, sem processos que afectam o resultado durante o tempo de medição real). FCS é adequado para o estudo da difusão de proteínas que são expressas em níveis típicos para mais proteínas endógenas. Aqui, um método simples e robusto para determinar a taxa de difusão de proteínas da membrana celular em linfócitos primários é demonstrada. Uma forma eficaz de realizar medições em células vivas marcadas com o anticorpo e observações que ocorrem comumente após a aquisição são descritos. Os avanços recentesno desenvolvimento de corantes fluorescentes foto-estável pode ser utilizada através da conjugação dos anticorpos de interesse de se apropriar corantes que não lixívia extensivamente durante as medições. Além disso, esta permite a detecção de entidades difundem-se lentamente, o que é uma característica comum de proteínas expressas em membranas celulares. O procedimento de análise para extrair parâmetros de concentração e difusão molecular a partir das curvas de autocorrelação gerados é realçado. Em resumo, um protocolo de base para medições de FCS é fornecida; ele pode ser seguido por imunologistas com uma compreensão de microscopia confocal, mas com nenhuma outra experiência anterior de técnicas para a medição de parâmetros dinâmicos, tais como taxas de difusão molecular.

Introduction

Muitas funções células imunitárias dependem de difusão molecular e interacções dentro de membranas. As membranas biológicas são complexas, e muitos factores que podem ser importantes para a função de células imunes pode influenciar a velocidade de difusão de translação de proteínas dentro das membranas celulares ^1. Recentemente, mostrou que as células assassinas naturais (NK), os linfócitos que pertencem ao sistema imune inato, exibem difusão diferencial de duas proteínas estudadas na membrana celular, dependendo do estado de activação da célula NK ^2.

espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS) é uma técnica que é capaz de quantificar as taxas de difusão molecular dentro de membranas biológicas. Ela reporta a taxa média de difusão de moléculas marcado por fluorescência em um volume fixo, tipicamente o foco de um microscópio confocal. Ele baseia-se na medição das flutuações em fluorescência que ocorre quando do movimento molecular emum sistema em estado estacionário. FCS tem sido amplamente utilizada para o estudo da difusão de corantes fluorescentes e de proteínas, tanto em solução como em membranas lipídicas. Outros parâmetros de saída afectam a taxa de difusão também pode ser indirectamente estudada dessa forma (por exemplo, mudanças de conformação das proteínas ou interacções das moléculas em membranas celulares) ^{3, 4.} FCS se destaca em comparação com outras técnicas, devido à sua alta sensibilidade, permitindo a possibilidade de detecção de uma única molécula. Ele funciona bem para concentrações moleculares na gama nanomolar a milimolar, o que é típico para os níveis de expressão endógenos da maioria das proteínas ^5. Além disso, FCS pode dar uma aproximação do número absoluto de proteínas dentro do volume estudadas, enquanto a maioria das outras técnicas só dão informação relativa sobre os níveis de expressão da proteína. Outros métodos para medir as taxas de difusão molecular em membranas incluem fluorecuperação rescência após a fotodegradação (FRAP), rastreamento única partícula (SPT), múltiplos pinhole FCS, e correlação imagem métodos. Métodos FRAP e correlação de imagem são técnicas de ensemble, que geralmente não dão informações sobre o número absoluto de moléculas ^10. Comparado a SPT, a taxa de transferência de FCS é maior em relação à caracterização da média da população. A análise também é menos exigente desde que a taxa média de difusão das moléculas presentes no foco do laser é medido, em vez da taxa de moléculas individuais. Além disso, a menos que microscópios especializados estão disponíveis ^11, SPT não pode dar qualquer informação sobre as concentrações, uma vez que a rotulagem padrão SPT deve ser muito baixa para permitir a identificação de moléculas individuais. Por outro lado, exige que as moléculas de FCS em estudo a ser móvel. Ele simplesmente não vai detectar eventuais frações ou moléculas imóveis putativos se movendo muito lentamente. A taxa de difusão das moléculas queresidir no foco mais do que cerca de um décimo do tempo de aquisição não serão correctamente representada nas medições FCS ^{3, 12.} Portanto, coeficientes de difusão gravadas por FCS tendem a ser mais rápido do que as taxas de difusão relatados a partir de técnicas como FRAP e SPT, onde as frações próxima do imóvel e muito lentas são levados em conta também. SPT também dará uma descrição mais pormenorizada da variação das taxas de difusão dentro da população molecular de FCS.

FCS quantifica a flutuação da intensidade de fluorescência ao longo do tempo dentro do volume animado. No caso das medições de membrana, isto traduz-se na área iluminada da membrana. Neste trabalho, nós utilizamos o fato de que essas flutuações são induzidas por moléculas que exibem difusão browniano e são, assim, mover dentro e fora do volume de excitação. Há também várias outras fontes possíveis para o fluctuações no sinal de fluorescência, tais como a piscar ou a presença de um estado tripleto nas fluoróforos, os efeitos ambientais, de ligação-unbinding do ligando, ou movimento da membrana da célula inteira. Estas fontes de erro putativos precisam ser levados em consideração ao projetar um experimento FCS, a fim de interpretar com precisão os resultados ^{12, 13.} Normalmente, as taxas de difusão lateral em membranas biológicas são baixos devido à aglomeração e interações, tanto entre as proteínas da membrana e entre proteínas e citoesqueleto. Historicamente, a utilização de FCS em membranas tem sido, assim, dificultada pela falta de fluoróforos foto-estáveis, que são necessárias para evitar o branqueamento durante os tempos de trânsito estendido através do foco de excitação ^14. No entanto, hoje em dia, há uma abundância de opções para corantes foto-estável adequados. melhorias significativas em detectores e outros equipamentos também permitem a detecção de prote fluorescenteins e corantes de brilho mais baixo. Aqui, um protocolo de base para a aplicação de FCS utilizando linfócitos primários de murino, em que a proteína de interesse é marcado com um anticorpo fluorescentemente marcado, é descrito. Uma abordagem para ajustar as curvas de autocorrelação, a fim de extrair o coeficiente de difusão e a densidade molecular também é mostrada. O protocolo visa ser facilmente seguido por imunologistas sem experiência prévia de técnicas para estudar a difusão de moléculas. No entanto, é esperado um entendimento básico de microscopia confocal (para ganhar esse entendimento básico, ver referência ^15). Este protocolo pode ser facilmente adaptado relativamente a outras células em suspensão, ambas linhas celulares e células primárias. Para os utilizadores mais experientes FCS, existem métodos de análise mais refinados, alguns dos quais são descritos na discussão.

Protocol

1. A coloração para FCS Isolar células NK de murino a partir de linfócitos do baço utilizando rotulagem esférulas magnéticas, de acordo com o protocolo do fabricante 16. Use 2-3 x 10 5 culas por amostra para os passos seguintes. NOTA: Use de selecção negativa para enriquecer a população de células alvo, deixando-a intacta, de modo que as células podem ser marcadas utilizando anticorpos primários sozinho. Ver referência 2 para obt…

Representative Results

Um resultado típico irá gerar uma curva de autocorrelação com um tempo de trânsito no intervalo de 10 ms para 400 ms para proteínas de membrana. O número de moléculas pode variar entre 0,5 a cerca de 200 ^ M por 2 para proteínas expressas endogenamente. Verifique cuidadosamente que o CPM não é menor do que o esperado. Isto pode significar que existe uma influência do sinal de fundo. Como regra geral, o sinal de CPM de células que é aceite para a análise não dev…

Discussion

Este protocolo para o FCS pode ser usada para a avaliação da dinâmica molecular de moléculas de superfície sobre todos os tipos de células do sistema imunológico (murinos, humana, ou de outras espécies). Medidas FCS dinâmica molecular espaço-temporais para baixo a resolução única molécula em células vivas. A densidade molecular, bem como a taxa de difusão e de agrupamento dinâmica das proteínas de interesse, podem ser extraídos a partir das curvas de autocorrelação.

A ma…

Materials

MACS NK Cell Isolation Kit mouse II	Miltenyi Biotec NordenAB	130-096-892	Negative selection of NK cells
Fetal Bovine Serum	Sigma-Adlrich	F7524	Heat inactivated
Phosphate Buffered Saline	–	–	Made in house
Roswell Park Memorial Institute medium 1640	PAA The Cell Culture Company	E15-848	Transparent medium
Antibody clone 2.4G2	Thermo Fischer Scientific	553140	For blocking Fc-receptors.
Anti-Ly49A antibody			Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647
Clone JR9.318
Anti-H-2Dd antibody	BD Pharmingen	558915	Conjugated in house to MFP488
Clone 34.5.8S
MFP488	Mobiotech	MFP-A2181	Fluorescent dye for antibody conjugation.
Poly-L-Lysine	Sigma-Aldrich	P8920	Diluted in distilled water (1.10)
Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa)	SuSoS AG	PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)	Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml.
Rhodamine 110 chloride	Sigma-Aldrich	432202	Known diffusion coefficient: 3.3 × 10−10 m2/s 19
Alexa fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A20006	Known diffusion coefficient: 4.4 × 10−10 m2/s 20
Confocal microscope	Zeiss	LSM510
Software: Confocor 3	Zeiss
Software: Matlab with curve fitting toolbox	Matlab	Version R2013b
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	Thermo-scientific	155411	8 wells, 1.0 borosilicate bottom