Fremstilling af rAAV9 at overudtrykke eller Knockdown gener i mus Hearts
Summary
In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.
Abstract
Styring af ekspressionen eller aktiviteten af specifikke gener gennem myocardial levering af genetisk materiale i murine modeller tillader undersøgelse af genfunktioner. Deres terapeutiske potentiale i hjertet kan også bestemmes. Der er begrænsede tilgange til in vivo molekylær intervention i muse hjerte. Rekombinant adenoassocieret virus (rAAV) -baseret genom engineering er blevet udnyttet som et vigtigt redskab til in vivo cardiac genmanipulation. De specifikke fordele ved denne teknologi omfatter høj effektivitet, høj specificitet, lav genomisk integration sats, minimal immunogenicitet, og minimal patogenicitet. Her er en detaljeret procedure til at konstruere, pakke, og rense rAAV9 vektorer beskrevet. Subkutan injektion af rAAV9 i neonatale hvalpe resulterer i robust ekspression eller effektiv knockdown af genet (er) af interesse i muse hjertet, men ikke i leveren og andre væv. Brug af hjerte–specic TnnT2 promotor, høj ekspression af GFP-genet i hjertet blev opnået. Derudover mål-mRNA blev inhiberet i hjertet, når en rAAV9-U6-shRNA blev anvendt. Arbejde viden om rAAV9 teknologi kan være nyttige for hjerte-kar-undersøgelser.
Introduction
Controlling ekspression eller aktivitet af specifikke gener i forskellige biologiske systemer er blevet en værdifuld strategi i studiet af genfunktion 1. Et direkte middel til at opnå dette mål er at manipulere nukleotidsekvenser og generere mutant alleler. Selv lave præcise, målrettede ændringer til genomet af levende celler er stadig en tidskrævende og arbejdskrævende praksis, har udviklingen af de magtfulde Talen og CRISPR / Cas9 værktøjer åbnet en ny æra af genom-redigering 2-5. En mere rutine laboratorium metode til genmanipulation har fokuseret på at indføre genetisk materiale (DNA og RNA, som indeholder kodende sekvenser eller siRNA'erne / shRNAs) ind i cellerne til at udtrykke eller knockdown genet (r) af interesse 1,6.
I mange tilfælde, de store hindringer for genmanipulation er levering af DNA, RNA eller protein i cellerne. Med hensyn til in vitro studier, effektiv transfectipå systemer er blevet etableret i mange dyrkede cellelinier. Men i musemodellen især in vivo genlevering er mere udfordrende. Der er en serie af ekstra- og intracellulære barrierer, der skal udkobles for at opnå en effektiv cellulær optagelse af de eksogene reagenser. Yderligere hindringer omfatter den hurtige clearance og den korte varighed af den leverede materialer 7,8. En strategi til at omgå disse problemer er at anvende virusvektorer som "bærere" eller "vehikler" til in vivo-genadministration. De naturligt udviklede transduktion egenskaber vira tillader effektiv levering af et gen af interesse i celler 7,9,10. Talrige typer af virale vektorer er blevet udviklet og muliggøre fleksibel in vivo genmanipulation i forskellige celletyper og organer i mus.
De mest almindeligt anvendte virale systemer indbefatter retrovirus, lentivirus, adenovirus og adeno-associeret virus (AAV) <sop> 11. Retrovira er enkeltstrengede RNA-vira og kan introducere deres genetiske materiale til værtscellegenomet på stabil måde under mitotisk deling, hvilket giver potentiale for livslang ekspression af de transducerede gener i målcellerne og organer 12-14. Men mange typer af retrovira kun inficere delende celler, og deres effektivitet i ikke-delende celler er meget lav 15. Dette begrænser deres anvendelighed til gen-levering. Lentivirus er en slægt af Retroviridae familien. Forskellige fra andre retrovira, kan lentivirus inficere både delende og ikke-delende celler og har været meget anvendt til genoverførsel til post-mitotiske og højt differentierede celler 16. Livscyklus lentivirus involverer også integrationen af vektor-DNA i værtsgenomet. Således lentivirus-medieret genlevering muliggør stabil og langvarig ekspression af de transducerede genetiske elementer 16-18. Imidlertid kan denne funktion repræsenterer en dobbelt-edged sværd i brugen af disse vira til at manipulere genekspressionen, som integration af vektor-DNA kan føre til insertionsmutagenese i værtscellerne og kan forårsage kulturgenstandsspor virkninger. Adenovirus er en anden udbredt gentildelingssystem. I modsætning retrovira og lentivirus, adenovirus er ikke-integreret og ikke forstyrrer det genomiske integritet værtsceller 8,10,11,19. Desuden kan Adenovira transficere DNA i mange celletyper, og infektion er ikke afhængig af aktiv celledeling 19. En anden vigtig egenskab ved Adenovira er den lethed af vektor oprensning som de virale vektorer har evnen til at blive gentaget 19,20. , De store forbehold ved dette system er, at adenovirus infektion kan udløse kraftige immunreaktioner i target celler og organer 19, der begrænser dens anvendelse i mange undersøgelser, især i genterapi undersøgelser.
Sammenlignet med disse anden types af virale vektorer, rekombinant Adenoassocieret virus (rAAV) synes at være den ideelle gentildelingssystem 21,22. Det udstiller minimal immunogenicitet og patogenicitet 23,24. Desuden rAAV inficerer en bred vifte af celletyper, herunder både delende og ikke-delende celler. I de fleste tilfælde har rAAV ikke integreres i værts-genomer; således, at risikoen for uønskede genetiske eller genomiske ændringer i målcellerne er lav 22.
For nylig er rAAV-systemer succes blevet brugt til in vivo levering af DNA, der koder proteiner, miRNA, shRNAs, og CRISPR-gRNAs i muse hjertemuskel 23,25-29. Denne metode har lettet fundamentale undersøgelser og genterapi undersøgelser inden for hjerte-kar-forskning. Her til den detaljerede procedure generere rAAV9 vektorer der effektivt overekspression eller knockdown generne af interesse i mus hjerter blev beskrevet. Protokollen giver en enkel og effektiv metode tilmanipulere kardial genekspression i murine forsøgsmodeller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er vigtigt at minimere uønsket ITR rekombination under plasmidkonstruktion. Før generering viruset, skal man altid overvåge ITR integritet AAV plasmider ved hjælp restriktionsfordøjelse og agarosegelelektroforese. Det er umuligt at opnå 100% intakte plasmider, men rekombinationen forholdet bør minimeres så meget som muligt. Mindre end 20% er acceptabel for en vellykket rAAV9 emballage. Af note, kan dyrkning af bakterierne ved lavere temperatur (30 ° C) med en lavere rystehastighed (180-200 rpm) reducere ris…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Zaffar Haque for careful reading of the manuscript. We thank Drs. Masaharu Kataoka and Gengze Wu for discussions and help. Work in the Wang lab is supported by the American Heart Association, Muscular Dystrophy Association, and NIH (HL085635, HL116919, HL125925).
Materials
| Polyethylenimine, Linear (MW 25,000) | Polysciences, Inc. | #23966-2 | |
| Tube, Polypropylene, 36.2 mL, 25 x 87 mm, (qty. 56) | Beckman Coulter, Inc | # 362183 | |
| Nuclease, ultrapure | SIGMA | #E8263-25KU | |
| Density Gradient Medium(Iodixanol) | SIGMA | #D1556-250ML | |
| Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD Millipore Corporation | #UFC910008 | |
| Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends,gauge 14, L 6 in., nickel plated hub | SIGMA | #CAD7942-12EA | |
| Poloxamer 188 solution (Pluronic® F-68 solution) | SIGMA | P5556-100ML | |
| Proteinase K | SIGMA | 3115828001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| DMEM medium | Fisher Scientific | SH30243FS | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| rAAV9 vector | Penn Vector Core | P1967 |
References
- Primrose, S. B., Twyman, R. . Principles of gene manipulation and genomics. , (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096 (2014).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat. Biotechnol. 32, 347-355 (2014).
- Szulc, J., Wiznerowicz, M., Sauvain, M. -. O., Trono, D., Aebischer, P. A versatile tool for conditional gene expression and knockdown. Nat. Methods. 3, 109-116 (2006).
- Nimesh, S., Halappanavar, S., Kaushik, N. K., Kumar, P. Advances in Gene Delivery Systems. BioMed Res. Int. 2015, 610342 (2015).
- Kamimura, K., Suda, T., Zhang, G., Liu, D. Advances in gene delivery systems. Pharm. Med. 25, 293-306 (2011).
- Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).
- Giacca, M., Zacchigna, S. Virus-mediated gene delivery for human gene therapy. J. Control Release. 161, 377-388 (2012).
- Witlox, M., Lamfers, M., Wuisman, P., Curiel, D., Siegal, G. Evolving gene therapy approaches for osteosarcoma using viral vectors: review. Bone. 40, 797-812 (2007).
- De Miguel, M. P., Cheng, L., Holland, E. C., Federspiel, M. J., Donovan, P. J. Dissection of the c-Kit signaling pathway in mouse primordial germ cells by retroviral-mediated gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 10458-10463 (2002).
- Nagano, M., Shinohara, T., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Retrovirus-mediated gene delivery into male germ line stem cells. FEBS Lett. 475, 7-10 (2000).
- Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 4626-4630 (1991).
- Katz, R. A., Greger, J. G., Skalka, A. M. Effects of cell cycle status on early events in retroviral replication. J. Cell. Biochem. 94, 880-889 (2005).
- Escors, D., Breckpot, K. Lentiviral vectors in gene therapy: their current status and future potential. Arch. Immunol. Ther. Exp. 58, 107-119 (2010).
- Mátrai, J., Chuah, M. K., VandenDriessche, T. Recent advances in lentiviral vector development and applications. Mol. Ther. 18, 477-490 (2010).
- Miyazaki, Y., Miyake, A., Nomaguchi, M., Adachi, A. Structural dynamics of retroviral genome and the packaging. Front. Microbiol. 2, 1-9 (2011).
- Douglas, J. T. Adenovirus-Mediated Gene Delivery. Gene Delivery to Mammalian Cells: Volume 2: Viral Gene Transfer Techniques. , 3-14 (2004).
- Armendáriz-Borunda, J., et al. Production of first generation adenoviral vectors for preclinical protocols: amplification, purification and functional titration. J. Biosci. Bioeng. 112, 415-421 (2011).
- Snyder, R. O. Adeno-associated virus-mediated gene delivery. J Gene Med. 1, 166-175 (1999).
- Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).
- Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene transfer in porcine myocardium after coronary infusion of an adeno-associated virus vector. Ann. Thorac. Surg. 62, 1669-1676 (1996).
- Kaspar, B. K., et al. Myocardial gene transfer and long-term expression following intracoronary delivery of adeno-associated virus. J. Gene. Med. 7, 316-324 (2005).
- Ding, J., et al. Trbp regulates heart function through microRNA-mediated Sox6 repression. Nat. Genet. 47, 776-783 (2015).
- Lin, Z., et al. Cardiac-specific YAP activation improves cardiac function and survival in an experimental murine MI model. Circ. Res. 115, 354-363 (2014).
- Wahlquist, C., et al. Inhibition of miR-25 improves cardiac contractility in the failing heart. Nature. 508, 531-535 (2014).
- Carroll, K. J., et al. A mouse model for adult cardiac-specific gene deletion with CRISPR/Cas9. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 113, 338-343 (2016).
- Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J., Seidman, C. E. Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy. Science. 342, 111-114 (2013).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6, 343-345 (2009).
- Rychlik, W., Spencer, W., Rhoads, R. Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro. Nucleic Acids Res. 18, 6409-6412 (1990).
- Allocca, M., et al. Serotype-dependent packaging of large genes in adeno-associated viral vectors results in effective gene delivery in mice. J. Clin. Invest. 118, 1955-1964 (2008).
- Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol. Ther. 18, 80-86 (2010).
- Li, J., Sun, W., Wang, B., Xiao, X., Liu, X. -. Q. Protein trans-splicing as a means for viral vector-mediated in vivo gene therapy. Hum. Gene Ther. 19, 958-964 (2008).
- Piras, B. A., O’Connor, D. M., French, B. A. Systemic delivery of shRNA by AAV9 provides highly efficient knockdown of ubiquitously expressed GFP in mouse heart, but not liver. PLoS One. 8, e75894 (2013).
- Lovric, J., et al. Terminal differentiation of cardiac and skeletal myocytes induces permissivity to AAV transduction by relieving inhibition imposed by DNA damage response proteins. Mol. Ther. 20, 2087-2097 (2012).
