Voorbereiding van de rAAV9 tot overexpressie of Knockdown Genes in Mouse Hearts
Summary
In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.
Abstract
Die de expressie of activiteit van specifieke genen door myocardiale afgifte van genetisch materiaal in muriene modellen maakt het onderzoek van genfuncties. Hun therapeutisch potentieel in het hart kan worden bepaald. Er zijn beperkte benadering voor in vivo moleculaire interventie in het muizenhart. Recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) gebaseerde genoom techniek is gebruikt als een essentieel instrument voor in vivo cardiale genmanipulatie. De specifieke voordelen van deze technologie zijn onder andere een hoge efficiëntie, hoge specificiteit, lage genomische integratie rate, minimale immunogeniciteit en weinig pathogeniciteit. Hier wordt een gedetailleerde procedure voor de bouw, verpakking, en zuiveren het rAAV9 vectoren beschreven. Subcutane injectie van rAAV9 in neonatale pups resulteert in robuuste expressie of efficiënte knockdown van het gen (en) van belang in het muizenhart, maar niet in de lever en andere weefsels. Met de cardiale specific TNNT2 promotor, hoge expressie van GFP-gen in het hart werd verkregen. Daarnaast richten mRNA werd geremd in het hart wanneer een rAAV9-U6-shRNA werd gebruikt. Praktische kennis van rAAV9 technologie kunnen nuttig zijn voor hart- en onderzoeken zijn.
Introduction
Regelen expressie of activiteit van specifieke genen in verschillende biologische systemen is een waardevol strategie het onderzoek van genfunctie 1. Een directe manier van de verwezenlijking van dit doel is om nucleotidesequenties te manipuleren en het genereren van mutante allelen. Hoewel het maken van nauwkeurige, doelgerichte wijzigingen aan het genoom van levende cellen nog een tijdrovend en arbeidsintensief praktijk, de ontwikkeling van de machtige TALEN en CRISPR / Cas9 gereedschap heeft een nieuw tijdperk van het genoom bewerken 2-5 geopend. Een routine laboratorium methode voor genetische manipulatie heeft zich gericht op de introductie van genetisch materiaal (DNA en RNA's die coderende sequenties of siRNA / shRNAs) in de cellen uit te drukken of knockdown het gen (s) van belang 1,6.
In veel gevallen, de belangrijke hinderpaal voor genmanipulatie is de afgifte van DNA, RNA of eiwit in de cellen. Wat in vitro studies, efficiënt transfectiop systemen zijn vastgesteld in veel gekweekte cellijnen. In het muismodel met name in vivo genafgifte is moeilijker. Er zijn een aantal extra- en intracellulaire barrières die moeten worden gepasseerd om efficiënte cellulaire opname van exogeen reagens bereiken. Extra obstakels onder meer de snelle klaring en de korte duur van de geleverde materialen 7,8. Een strategie om deze problemen te omzeilen is om virale vectoren als "dragers" of "auto" in vivo genafgifte. De natuur geëvolueerd transductie eigenschappen van virussen mogelijk maken de efficiënte levering van een gen van belang in cellen 7,9,10. Talrijke types van virale vectoren zijn ontwikkeld en maken flexibele in vivo genmanipulatie in verschillende organen en cellen in muizen.
De meest gebruikte virale systemen omvatten Retrovirus, Lentivirus, adenovirus en adeno-geassocieerde virus (AAV) <sup> 11. Retrovirussen zijn enkelstrengs RNA-virussen en hun genetisch materiaal naar het gastheergenoom op stabiele wijze gedurende mitose voeren, waardoor nog levenslange expressie van het getransduceerde genen in de doelwitcellen en organen 12-14. Veel soorten retrovirussen alleen delende cellen infecteren en hun doeltreffendheid in niet-delende cellen zeer laag 15. Dit beperkt hun nut voor gen-levering. Lentivirus is een geslacht van de familie Retroviridae. Anders dan andere retrovirussen, Lentivirus kan zowel delende als niet-delende cellen infecteren en is op grote schaal gebruikt voor genoverdracht in post-mitotisch en zeer gedifferentieerde cellen 16. De levenscyclus van Lentivirus omvat ook de integratie van vector DNA in het gastheergenoom. Aldus Lentivirus-gemedieerde genafgifte worden stabiele en langdurige expressie van het getransduceerde genetische elementen 16-18. Dit kan echter voorzien van een double-e vertegenwoordigendged zwaard in het gebruik van deze virussen om genexpressie te manipuleren, de integratie van vector DNA kan leiden tot mutagenese in de gastheercellen en kunnen artefact veroorzaken. Adenovirus andere veelgebruikte genafgiftesysteem. Anders dan retrovirussen en lentivirussen, adenovirussen zijn niet geïntegreerd en niet interfereren met de genomische integriteit van gastheercellen 8,10,11,19. Bovendien kunnen adenovirussen transfecteren DNA in vele celtypen, en infectie niet afhankelijk actieve celdeling 19. Een ander belangrijk kenmerk van adenovirussen is het gemak van vector zuivering als virale vectoren de mogelijkheid te repliceren 19,20. De belangrijkste nadeel van dit systeem is dat adenovirus infectie kan leiden tot sterke immuunresponsen in doelwitcellen en organen 19, beperkt het gebruik ervan in verschillende onderzoeken, in het bijzonder bij gentherapie studies.
Vergeleken met deze verschillende typens van virale vectoren, wordt recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) naar het ideale genafgiftesysteem 21,22 zijn. Het vertoont een minimale immunogeniciteit en pathogeniciteit 23,24. Bovendien rAAV infecteert een breed scala aan celtypen, waaronder zowel verdelen en niet-delende cellen. In de meeste gevallen is rAAV niet te integreren in ontvangst genomen; waardoor het risico van ongewenste genetische of genomische veranderingen in de doelcellen laag 22.
Recentelijk rAAV systemen met succes gebruikt voor de in vivo afgifte van DNA coderend voor eiwitten, miRNAs, shRNAs en CRISPR-gRNAs in muis hartspier 23,25-29. Deze methode heeft fundamenteel onderzoek en gentherapie studies vergemakkelijkt het gebied van cardiovasculair onderzoek. Hier, de gedetailleerde procedure om rAAV9 vectoren die efficiënt overexpressie of knockdown de genen van belang in muisharten werd beschreven te genereren. Het protocol voorziet in een eenvoudige en effectieve methodemanipuleren van cardiale genexpressie in muizen experimentele modellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het is belangrijk om ongewenste ITR recombinatie te minimaliseren tijdens plasmideconstructie. Vóór het genereren van het virus, moet men altijd controleren de ITR integriteit van de AAV plasmiden met restrictie digestie en agarosegelelektroforese. Het is onmogelijk om 100% intacte plasmiden te verkrijgen, maar de verhouding recombinatie moet zoveel mogelijk worden beperkt. Minder dan 20% aanvaardbaar is voor een succesvolle rAAV9 verpakking. Opmerkelijk, kweken van de bacteriën bij lagere temperatuur (30 ° C) met e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Zaffar Haque for careful reading of the manuscript. We thank Drs. Masaharu Kataoka and Gengze Wu for discussions and help. Work in the Wang lab is supported by the American Heart Association, Muscular Dystrophy Association, and NIH (HL085635, HL116919, HL125925).
Materials
| Polyethylenimine, Linear (MW 25,000) | Polysciences, Inc. | #23966-2 | |
| Tube, Polypropylene, 36.2 mL, 25 x 87 mm, (qty. 56) | Beckman Coulter, Inc | # 362183 | |
| Nuclease, ultrapure | SIGMA | #E8263-25KU | |
| Density Gradient Medium(Iodixanol) | SIGMA | #D1556-250ML | |
| Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD Millipore Corporation | #UFC910008 | |
| Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends,gauge 14, L 6 in., nickel plated hub | SIGMA | #CAD7942-12EA | |
| Poloxamer 188 solution (Pluronic® F-68 solution) | SIGMA | P5556-100ML | |
| Proteinase K | SIGMA | 3115828001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| DMEM medium | Fisher Scientific | SH30243FS | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| rAAV9 vector | Penn Vector Core | P1967 |
References
- Primrose, S. B., Twyman, R. . Principles of gene manipulation and genomics. , (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096 (2014).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat. Biotechnol. 32, 347-355 (2014).
- Szulc, J., Wiznerowicz, M., Sauvain, M. -. O., Trono, D., Aebischer, P. A versatile tool for conditional gene expression and knockdown. Nat. Methods. 3, 109-116 (2006).
- Nimesh, S., Halappanavar, S., Kaushik, N. K., Kumar, P. Advances in Gene Delivery Systems. BioMed Res. Int. 2015, 610342 (2015).
- Kamimura, K., Suda, T., Zhang, G., Liu, D. Advances in gene delivery systems. Pharm. Med. 25, 293-306 (2011).
- Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).
- Giacca, M., Zacchigna, S. Virus-mediated gene delivery for human gene therapy. J. Control Release. 161, 377-388 (2012).
- Witlox, M., Lamfers, M., Wuisman, P., Curiel, D., Siegal, G. Evolving gene therapy approaches for osteosarcoma using viral vectors: review. Bone. 40, 797-812 (2007).
- De Miguel, M. P., Cheng, L., Holland, E. C., Federspiel, M. J., Donovan, P. J. Dissection of the c-Kit signaling pathway in mouse primordial germ cells by retroviral-mediated gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 10458-10463 (2002).
- Nagano, M., Shinohara, T., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Retrovirus-mediated gene delivery into male germ line stem cells. FEBS Lett. 475, 7-10 (2000).
- Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 4626-4630 (1991).
- Katz, R. A., Greger, J. G., Skalka, A. M. Effects of cell cycle status on early events in retroviral replication. J. Cell. Biochem. 94, 880-889 (2005).
- Escors, D., Breckpot, K. Lentiviral vectors in gene therapy: their current status and future potential. Arch. Immunol. Ther. Exp. 58, 107-119 (2010).
- Mátrai, J., Chuah, M. K., VandenDriessche, T. Recent advances in lentiviral vector development and applications. Mol. Ther. 18, 477-490 (2010).
- Miyazaki, Y., Miyake, A., Nomaguchi, M., Adachi, A. Structural dynamics of retroviral genome and the packaging. Front. Microbiol. 2, 1-9 (2011).
- Douglas, J. T. Adenovirus-Mediated Gene Delivery. Gene Delivery to Mammalian Cells: Volume 2: Viral Gene Transfer Techniques. , 3-14 (2004).
- Armendáriz-Borunda, J., et al. Production of first generation adenoviral vectors for preclinical protocols: amplification, purification and functional titration. J. Biosci. Bioeng. 112, 415-421 (2011).
- Snyder, R. O. Adeno-associated virus-mediated gene delivery. J Gene Med. 1, 166-175 (1999).
- Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).
- Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene transfer in porcine myocardium after coronary infusion of an adeno-associated virus vector. Ann. Thorac. Surg. 62, 1669-1676 (1996).
- Kaspar, B. K., et al. Myocardial gene transfer and long-term expression following intracoronary delivery of adeno-associated virus. J. Gene. Med. 7, 316-324 (2005).
- Ding, J., et al. Trbp regulates heart function through microRNA-mediated Sox6 repression. Nat. Genet. 47, 776-783 (2015).
- Lin, Z., et al. Cardiac-specific YAP activation improves cardiac function and survival in an experimental murine MI model. Circ. Res. 115, 354-363 (2014).
- Wahlquist, C., et al. Inhibition of miR-25 improves cardiac contractility in the failing heart. Nature. 508, 531-535 (2014).
- Carroll, K. J., et al. A mouse model for adult cardiac-specific gene deletion with CRISPR/Cas9. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 113, 338-343 (2016).
- Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J., Seidman, C. E. Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy. Science. 342, 111-114 (2013).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6, 343-345 (2009).
- Rychlik, W., Spencer, W., Rhoads, R. Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro. Nucleic Acids Res. 18, 6409-6412 (1990).
- Allocca, M., et al. Serotype-dependent packaging of large genes in adeno-associated viral vectors results in effective gene delivery in mice. J. Clin. Invest. 118, 1955-1964 (2008).
- Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol. Ther. 18, 80-86 (2010).
- Li, J., Sun, W., Wang, B., Xiao, X., Liu, X. -. Q. Protein trans-splicing as a means for viral vector-mediated in vivo gene therapy. Hum. Gene Ther. 19, 958-964 (2008).
- Piras, B. A., O’Connor, D. M., French, B. A. Systemic delivery of shRNA by AAV9 provides highly efficient knockdown of ubiquitously expressed GFP in mouse heart, but not liver. PLoS One. 8, e75894 (2013).
- Lovric, J., et al. Terminal differentiation of cardiac and skeletal myocytes induces permissivity to AAV transduction by relieving inhibition imposed by DNA damage response proteins. Mol. Ther. 20, 2087-2097 (2012).
