Preparação de rAAV9 para superexpressão ou Knockdown Genes em mouse Corações
Summary
In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.
Abstract
Controlando a expressão ou actividade de genes específicos por meio da entrega de materiais genéticos miocárdica em modelos de murino permite a investigação de funções de genes. O seu potencial terapêutico no coração pode também ser determinada. Existem abordagens limitadas para a intervenção molecular in vivo, no coração de rato. Vírus adeno-associado (rAAV) engenharia de genoma baseada recombinante tem sido utilizada como uma ferramenta essencial para a manipulação genética cardíaca in vivo. As vantagens específicas de esta tecnologia incluem alta eficiência, de alta especificidade, baixa taxa de integração genómica, mínimo imunogenicidade, patogenicidade e mínima. Aqui, é descrito um procedimento detalhado para a construção, pacote, e purificar os vetores rAAV9. A injecção subcutânea de rAAV9 em crias recém-nascidos resulta em expressão robusta ou knockdown eficiente do gene (s) de interesse no coração de rato, mas não no fígado e outros tecidos. Usando o cardíaca-específiObteve-se C TNNT2 promotor, elevada expressão do gene GFP no coração. Além disso, sequências alvo de ARNm foi inibida no coração quando um rAAV9-U6-shRNA foi utilizado. Trabalhando conhecimento da tecnologia rAAV9 pode ser útil para as investigações cardiovasculares.
Introduction
Controlando a expressão ou actividade de genes específicos em vários sistemas biológicos tornou-se uma estratégia terapêutica valiosa no estudo da função do gene 1. Uma forma directa de alcançar este objectivo é para manipular sequências de nucleótidos e de gerar alelos mutantes. Apesar de fazer, alterações específicas precisos para o genoma de células vivas ainda é um demorado e práticas de trabalho intensivo, o desenvolvimento das poderosas ferramentas TALEN e CRISPR / Cas9 abriu uma nova era de edição genoma 2-5. Um método de laboratório mais rotina para manipulação genética tem-se centrado sobre a introdução de materiais genéticos (DNAs e RNAs contendo sequências codificantes ou siRNAs / shRNAs) nas células de expressar ou knockdown do gene (s) de interesse 1,6.
Em muitos casos, o principal ponto de estrangulamento para a manipulação de genes é a entrega de ADN, ARN, ou proteínas nas células. No que se refere a estudos in vitro, transfecti eficienteem sistemas foram estabelecidas em muitas linhas de células cultivadas. No entanto, no modelo de ratinho, em particular, na entrega de genes in vivo é mais difícil. Há uma série de barreiras extra e intracelulares que precisam ser contornado, de modo a conseguir a absorção celular eficiente dos reagentes exógenos. Obstáculos adicionais incluem a rápida depuração ea curta duração do 7,8 materiais entregues. Uma estratégia para contornar esses problemas é a utilização de vetores virais como "portadores" ou "veículos" para na entrega de genes in vivo. As propriedades de transdução naturalmente evoluídos de vírus permitir o fornecimento eficiente de um gene de interesse em células 7,9,10. Numerosos tipos de vectores virais têm sido desenvolvidos e permitir flexível na manipulação de genes in vivo em diferentes tipos de células e órgãos de ratinhos.
Os sistemas virais mais comumente usadas incluem retrovírus, lentivírus, adenovírus, e vírus adeno-associado (AAV) <s-se> 11. Os retrovírus são vírus de ARN de cadeia simples e pode introduzir o seu material genético para o genoma da célula hospedeira de uma forma estável durante a divisão mitótica, proporcionando o potencial para a expressão ao longo da vida dos genes transduzidas nas células e órgãos alvo 12-14. No entanto, muitos tipos de retrovírus apenas para infectar células em divisão, e a sua eficácia nas células que não se dividem 15 é muito baixa. Isto limita a sua utilidade para a entrega de genes. Lentivírus é um gênero da família Retroviridae. Diferente de outros retrovírus, lentivírus pode infectar tanto células em divisão e que não se dividem e tem sido amplamente utilizado para a transferência de genes em pós-mitótico e células altamente diferenciadas 16. O ciclo de vida de lentivírus também envolve a integração do ADN do vector no genoma do hospedeiro. Assim, a entrega de genes, mediada Lentivírus permite a expressão estável e de longa duração dos elementos genéticos transduzidas 16-18. No entanto, esse recurso pode representar um duplo-eespada DGED na utilização destes vírus para manipular a expressão de genes, a integração do DNA vector pode levar a mutagénese de inserção nas células hospedeiras e podem causar efeitos artefatuais. O adenovírus é um outro sistema de entrega de genes amplamente utilizado. Ao contrário dos retrovírus e lentivírus, adenovírus são não integrado e não interfere com a integridade genómica de células hospedeiras 8,10,11,19. Além disso, adenovírus pode transfectar ADN em muitos tipos de células, e a infecção não é dependente de divisão celular activa 19. Outra característica importante de adenovírus é a facilidade de purificação do vector, como os vectores virais têm a capacidade de ser replicado 19,20. No entanto, a ressalva importante deste sistema é que a infecção com adenovírus pode provocar fortes respostas imunitárias em células e órgãos alvo 19, limitando o seu uso em muitas investigações, particularmente em estudos de terapia génica.
Comparado com estes diferentes tiposs de vectores virais, vírus recombinante adeno-associado (rAAV) parece ser o sistema de entrega de genes ideal 21,22. Ela exibe imunogenicidade mínima e patogenicidade 23,24. Além disso, de rAAV infecta uma ampla gama de tipos de células, incluindo ambas as células que não se dividem e divisória. Na maioria dos casos, rAAV não se integra nos genomas de acolhimento; Assim, o risco de alterações genéticas ou genómicas indesejáveis nas células alvo é baixa 22.
Recentemente, sistemas de rAAV foram usadas com êxito para a administração in vivo de ADN que codifica proteínas, miARNs, shRNAs, e CRISPR-gRNAs no músculo cardíaco do rato 23,25-29. Esta metodologia tem facilitado investigações fundamentais e estudos de terapia gênica no domínio da investigação cardiovascular. Aqui, o procedimento detalhado para gerar vectores rAAV9 que sobre-expressam de forma eficiente ou eliminação dos genes de interesse em corações de rato foi descrito. O protocolo proporciona um método simples e eficaz demanipular a expressão de genes cardíacos em modelos experimentais de murino.
Protocol
Representative Results
Discussion
É importante minimizar a recombinação indesejada ITR durante a construção do plasmídeo. Antes de gerar o vírus, deve-se controlar sempre a integridade ITR dos plasmídeos de AAV, utilizando a digestão de restrição e electroforese em gel de agarose. É impossível obter 100% plasmídeos intactos, mas a razão de recombinação deve ser minimizado tanto quanto possível. Menos de 20% é aceitável para embalagem rAAV9 bem sucedida. De nota, a cultura das bactérias a temperatura mais baixa (30 ° C) com uma velo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Zaffar Haque for careful reading of the manuscript. We thank Drs. Masaharu Kataoka and Gengze Wu for discussions and help. Work in the Wang lab is supported by the American Heart Association, Muscular Dystrophy Association, and NIH (HL085635, HL116919, HL125925).
Materials
| Polyethylenimine, Linear (MW 25,000) | Polysciences, Inc. | #23966-2 | |
| Tube, Polypropylene, 36.2 mL, 25 x 87 mm, (qty. 56) | Beckman Coulter, Inc | # 362183 | |
| Nuclease, ultrapure | SIGMA | #E8263-25KU | |
| Density Gradient Medium(Iodixanol) | SIGMA | #D1556-250ML | |
| Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD Millipore Corporation | #UFC910008 | |
| Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends,gauge 14, L 6 in., nickel plated hub | SIGMA | #CAD7942-12EA | |
| Poloxamer 188 solution (Pluronic® F-68 solution) | SIGMA | P5556-100ML | |
| Proteinase K | SIGMA | 3115828001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| DMEM medium | Fisher Scientific | SH30243FS | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| rAAV9 vector | Penn Vector Core | P1967 |
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