Подготовка rAAV9 к гиперэкспрессией или Нокдаун Гены в мышиных сердец
Summary
In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.
Abstract
Контроль экспрессии или активности специфических генов через инфарктом доставки генетического материала в мышиных моделях позволяет исследовать функции генов. Их терапевтический потенциал в сердце может быть также определена. Существуют ограниченные подходы к молекулярной вмешательства в естественных условиях в сердце мыши. Рекомбинантный аденовирус-ассоциированный вирус (Раав) основе генной инженерии была использована в качестве основного инструмента для сердца манипуляции генов в естественных условиях. Особые преимущества этой технологии включают в себя высокую эффективность, высокую специфичность, низкий уровень геномную интеграции, минимальный иммуногенность, и минимальный патогенность. Здесь подробно процедура построения, упаковки и очистить векторы rAAV9 описано. Подкожное введение rAAV9 в неонатальных крысят приводит к надежной экспрессии или эффективной нокдауна гена (ов), представляющие интерес в сердце мыши, но не в печени и других тканях. Использование сердечной Удельныйбыл получен с TnnT2 промотор, высокий уровень экспрессии гена GFP в сердце. Кроме того, мРНК-мишени ингибируется в сердце, когда использовали rAAV9-U6-shRNA. Практическое знание технологии rAAV9 могут быть полезны для сердечно-сосудистых исследований.
Introduction
Контроль экспрессии или активности специфических генов в различных биологических системах стала ценной стратегией при изучении функции гена 1. Прямым средством достижения этой цели является манипулировать нуклеотидные последовательности и генерируют мутантные аллели. Несмотря на то, что делает точные, целенаправленные изменения в геном живых клеток по-прежнему отнимающий много времени и трудоемкая практика, развитие мощных инструментов Talen и Crispr / cas9 открыл новую эру редактирования генома 2-5. Более рутинной лабораторный метод для генных манипуляций была сосредоточена на введении генетических материалов (ДНК и РНК , содержащих кодирующие последовательности или миРНК / shRNAs) в клетках , чтобы выразить или нокдауна ген (ы) интерес 1,6.
Во многих случаях основным сдерживающим генная инженерия является доставка ДНК, РНК или белка в клетки. Что касается исследований в лабораторных условиях , эффективного transfectiв системах, были установлены во многих культивируемых клеточных линий. Тем не менее, в мышиной модели , в частности, в естественных условиях доставки гена является более сложной задачей. Есть целый ряд внеклеточном и внутриклеточном барьеров, которые необходимо обойти для достижения эффективного клеточного поглощения экзогенных реагентов. Дополнительные препятствия включают быстрый клиренс и короткую продолжительность поставляемого материалов 7,8. Одна из стратегий , чтобы обойти эти проблемы является использование вирусных векторов в качестве "носителей" или "транспортные средства" для в естественных условиях доставки генов. Естественно-эволюционировали свойства трансдукции вирусов позволяют эффективную доставку интересующего гена в клетки 7,9,10. Известны многочисленные типы вирусных векторов, были разработаны и позволяют гибко в естественных условиях манипуляции генов в различных типах клеток и органов у мышей.
Наиболее часто используемые вирусные системы включают ретровирусов, лентивирусов, аденовирусы и адено-ассоциированный вирус (AAV) <sдо> 11. Ретровирусы одноцепочечных РНК – вирусы и могут ввести свой генетический материал в геном клетки – хозяина в стабильном состоянии во время митотического деления, обеспечивая потенциал для непрерывного экспрессии генов в трансдуцированных клеток – мишеней и органов 12-14. Тем не менее, многие виды ретровирусов инфицируют только делящиеся клетки, и их эффективность в непролиферирующих клетках очень низкий 15. Это ограничивает их полезность для доставки генов. Лентивирус является род семейства ретровирусы. В отличие от других ретровирусов, Лентивирус может заражающие как разделительные и не делящиеся клетки и широко используется для переноса генов в постмитотическими и высоко дифференцированных клеток 16. Жизненный цикл Лентивирус также включает в себя интеграцию векторной ДНК в геном хозяина. Таким образом, Лентивирус-опосредованной доставки генов обеспечивает стабильную и длительную экспрессию трансдуцированных генетических элементов 16-18. Тем не менее, эта функция может представлять собой двойную-еdged меча в использовании этих вирусов манипулировать экспрессию генов, а интеграция векторной ДНК, может привести к инсерционного мутагенеза в клетках-хозяевах и может вызвать артефактного эффекты. Аденовирус является еще одним широко используемой системой доставки генов. В отличие от ретровирусов и лентивирусов, аденовирусов неинтегрированы и не мешают геномного целостности клеток – хозяев , 8,10,11,19. Кроме того, аденовирусы могут трансфекцию ДНК во многие типы клеток, и инфекция не зависит от активной клеточного деления 19. Другой важной характеристикой аденовирусов является легкость очистки вектора, как вирусные векторы имеют возможность быть воспроизведен 19,20. Тем не менее, основной нюанс этой системы является то, что аденовирус – инфекция может вызвать сильный иммунный ответ в клетках – мишенях и органов 19, ограничивающей его применение во многих исследованиях, в частности , в исследованиях по генной терапии.
По сравнению с этими различного типаs вирусных векторов, рекомбинантный аденосателлитные вирус (Раав) , как представляется , система доставки 21,22 идеальным гена. Он обладает минимальной иммуногенность и патогенность 23,24. Кроме того, Раав инфицирует широкий спектр типов клеток, в том числе и как разделяющего непролиферирующих клеток. В большинстве случаев Раав не интегрируется в хост геномов; Таким образом, риск нежелательных генетических или геномных изменений в клетках – мишенях является низким 22.
В последнее время системы Раав были успешно использованы для доставки в естественных условиях ДНК , кодирующей белки, микроРНК, shRNAs и Crispr-gRNAs в сердечной мышцы мыши 23,25-29. Эта методика способствовала фундаментальных исследований и исследований генной терапии в области сердечно-сосудистых исследований. Здесь подробная процедура генерации векторов rAAV9, которые эффективно сверхэкспрессируют или нокдауна генов, представляющих интерес в сердцах мышей было описано. Протокол обеспечивает простой и эффективный методманипулируя экспрессию генов сердца в мышиных экспериментальных моделях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Важно, чтобы свести к минимуму нежелательную ITR рекомбинации во время плазмидной конструкции. Перед созданием вируса, всегда нужно следить за целостностью ITR из AAV плазмиды с помощью рестрикции переваривания и электрофореза в агарозном геле. Невозможно получить 100% интактного плазмид, ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Zaffar Haque for careful reading of the manuscript. We thank Drs. Masaharu Kataoka and Gengze Wu for discussions and help. Work in the Wang lab is supported by the American Heart Association, Muscular Dystrophy Association, and NIH (HL085635, HL116919, HL125925).
Materials
| Polyethylenimine, Linear (MW 25,000) | Polysciences, Inc. | #23966-2 | |
| Tube, Polypropylene, 36.2 mL, 25 x 87 mm, (qty. 56) | Beckman Coulter, Inc | # 362183 | |
| Nuclease, ultrapure | SIGMA | #E8263-25KU | |
| Density Gradient Medium(Iodixanol) | SIGMA | #D1556-250ML | |
| Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD Millipore Corporation | #UFC910008 | |
| Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends,gauge 14, L 6 in., nickel plated hub | SIGMA | #CAD7942-12EA | |
| Poloxamer 188 solution (Pluronic® F-68 solution) | SIGMA | P5556-100ML | |
| Proteinase K | SIGMA | 3115828001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| DMEM medium | Fisher Scientific | SH30243FS | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| rAAV9 vector | Penn Vector Core | P1967 |
References
- Primrose, S. B., Twyman, R. . Principles of gene manipulation and genomics. , (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096 (2014).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat. Biotechnol. 32, 347-355 (2014).
- Szulc, J., Wiznerowicz, M., Sauvain, M. -. O., Trono, D., Aebischer, P. A versatile tool for conditional gene expression and knockdown. Nat. Methods. 3, 109-116 (2006).
- Nimesh, S., Halappanavar, S., Kaushik, N. K., Kumar, P. Advances in Gene Delivery Systems. BioMed Res. Int. 2015, 610342 (2015).
- Kamimura, K., Suda, T., Zhang, G., Liu, D. Advances in gene delivery systems. Pharm. Med. 25, 293-306 (2011).
- Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).
- Giacca, M., Zacchigna, S. Virus-mediated gene delivery for human gene therapy. J. Control Release. 161, 377-388 (2012).
- Witlox, M., Lamfers, M., Wuisman, P., Curiel, D., Siegal, G. Evolving gene therapy approaches for osteosarcoma using viral vectors: review. Bone. 40, 797-812 (2007).
- De Miguel, M. P., Cheng, L., Holland, E. C., Federspiel, M. J., Donovan, P. J. Dissection of the c-Kit signaling pathway in mouse primordial germ cells by retroviral-mediated gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 10458-10463 (2002).
- Nagano, M., Shinohara, T., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Retrovirus-mediated gene delivery into male germ line stem cells. FEBS Lett. 475, 7-10 (2000).
- Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 4626-4630 (1991).
- Katz, R. A., Greger, J. G., Skalka, A. M. Effects of cell cycle status on early events in retroviral replication. J. Cell. Biochem. 94, 880-889 (2005).
- Escors, D., Breckpot, K. Lentiviral vectors in gene therapy: their current status and future potential. Arch. Immunol. Ther. Exp. 58, 107-119 (2010).
- Mátrai, J., Chuah, M. K., VandenDriessche, T. Recent advances in lentiviral vector development and applications. Mol. Ther. 18, 477-490 (2010).
- Miyazaki, Y., Miyake, A., Nomaguchi, M., Adachi, A. Structural dynamics of retroviral genome and the packaging. Front. Microbiol. 2, 1-9 (2011).
- Douglas, J. T. Adenovirus-Mediated Gene Delivery. Gene Delivery to Mammalian Cells: Volume 2: Viral Gene Transfer Techniques. , 3-14 (2004).
- Armendáriz-Borunda, J., et al. Production of first generation adenoviral vectors for preclinical protocols: amplification, purification and functional titration. J. Biosci. Bioeng. 112, 415-421 (2011).
- Snyder, R. O. Adeno-associated virus-mediated gene delivery. J Gene Med. 1, 166-175 (1999).
- Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).
- Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene transfer in porcine myocardium after coronary infusion of an adeno-associated virus vector. Ann. Thorac. Surg. 62, 1669-1676 (1996).
- Kaspar, B. K., et al. Myocardial gene transfer and long-term expression following intracoronary delivery of adeno-associated virus. J. Gene. Med. 7, 316-324 (2005).
- Ding, J., et al. Trbp regulates heart function through microRNA-mediated Sox6 repression. Nat. Genet. 47, 776-783 (2015).
- Lin, Z., et al. Cardiac-specific YAP activation improves cardiac function and survival in an experimental murine MI model. Circ. Res. 115, 354-363 (2014).
- Wahlquist, C., et al. Inhibition of miR-25 improves cardiac contractility in the failing heart. Nature. 508, 531-535 (2014).
- Carroll, K. J., et al. A mouse model for adult cardiac-specific gene deletion with CRISPR/Cas9. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 113, 338-343 (2016).
- Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J., Seidman, C. E. Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy. Science. 342, 111-114 (2013).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6, 343-345 (2009).
- Rychlik, W., Spencer, W., Rhoads, R. Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro. Nucleic Acids Res. 18, 6409-6412 (1990).
- Allocca, M., et al. Serotype-dependent packaging of large genes in adeno-associated viral vectors results in effective gene delivery in mice. J. Clin. Invest. 118, 1955-1964 (2008).
- Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol. Ther. 18, 80-86 (2010).
- Li, J., Sun, W., Wang, B., Xiao, X., Liu, X. -. Q. Protein trans-splicing as a means for viral vector-mediated in vivo gene therapy. Hum. Gene Ther. 19, 958-964 (2008).
- Piras, B. A., O’Connor, D. M., French, B. A. Systemic delivery of shRNA by AAV9 provides highly efficient knockdown of ubiquitously expressed GFP in mouse heart, but not liver. PLoS One. 8, e75894 (2013).
- Lovric, J., et al. Terminal differentiation of cardiac and skeletal myocytes induces permissivity to AAV transduction by relieving inhibition imposed by DNA damage response proteins. Mol. Ther. 20, 2087-2097 (2012).
