Fare Kalpler eksprese rAAV9 hazırlanması veya demonte Genler
Summary
In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.
Abstract
sıçan modellerinde genetik materyallerin miyokard teslim yoluyla ifade ya da belirli genlerin aktivitesini kontrol eden gen fonksiyonlarının soruşturma izin verir. merkezinde Bunların terapötik potansiyeli de belirlenebilir. Fare kalp in vivo molekül müdahale sınırlı yaklaşımlar bulunmaktadır. Rekombinant adeno-bağlantılı virüsü (AAV) tabanlı genom mühendisliği in vivo kardiyak gen manipülasyonu için gerekli bir araç olarak kullanılmıştır. Bu teknolojinin belirli avantajları minimal yüksek verimlilik, yüksek özgüllük, düşük genomik entegrasyon oranı dahil immünojenisite ve minimal patojenite. Burada, rAAV9 vektörleri, inşa paket ve arındırmak için detaylı bir prosedür açıklanmıştır. Yenidoğan yavruların halinde rAAV9 deri altı enjeksiyonu, karaciğer ve diğer dokularında güçlü bir ifade ya da fare kalbinde ilgili gen (ler) in etkin bir devirme ile sonuçlanır, fakat. Kalp-specifi kullanarakCı TnnT2 promoteri, kalp GFP geninin yüksek elde edildi. Ayrıca, rAAV9-U6-ShRNA kullanılmıştır zaman mRNA kalbinde inhibe edilmiştir hedef. rAAV9 teknoloji bilgisi çalışma kardiyovasküler araştırmalar için de faydalı olabilir.
Introduction
Çeşitli biyolojik sistemlerde, belirli genlerin dışavurumu ya da aktivitesini kontrol gen fonksiyonu 1 çalışmasında değerli bir strateji haline gelmiştir. Bu amacı gerçekleştirmek doğrudan bir aracı nükleotid dizilerini işlemek ve mutant alelleri üretmektir. canlı hücre genomuna kesin ve hedeflenen bir değişiklik yapmak hala olmasına rağmen Bir zaman alıcı ve emek yoğun bir uygulamadır, güçlü TALEN ve CRISPR / Cas9 araçlarının geliştirilmesi genom düzenleme 2-5 yeni bir dönem açtı. Gen manipülasyonu için daha rutin laboratuvar yöntemi genetik malzemeler (DNA'lar ve kodlama dizileri veya siRNA'lar / shRNAs içeren RNA'lar) açık veya ilgi 1,6 gen (ler) demonte hücrelerin içine giriş odaklanmıştır.
Pek çok durumda, gen manipülasyonu için büyük bir darboğaz hücrelerine DNA, RNA ya da protein verilmesidir. In vitro çalışmalarda dikkate alarak, verimli transfecti ilesistemlerde çok kültürlenmiş hücre çizgileri kurulmuştur. Bununla birlikte, özellikle de fare modelinde in vivo gen aktarım daha zordur. Eksojen reaktiflerin etkili biçimde hücreye alınması elde edilmesi amacıyla bypass gereken ekstra ve hücre içi engellerin bir dizi işlem bulunmaktadır. Ek engeller, hızlı temizleme ve teslim malzemeler 7,8 kısa süreli içerir. Bu sorunları aşmak için bir strateji, in vivo gen aktarımı için "taşıyıcılar" veya "araçlar" gibi viral vektörler kullanmaktır. Virüslerin doğal olarak gelişmiş iletim özellikleri hücre 7,9,10 söz konusu bir genin etkin bir dağıtımını sağlar. Viral vektörlerin çok sayıda türleri geliştirilmiş ve farelerde, farklı hücre tipleri ve organların in vivo gen manipülasyonu esnek olanak edilmiştir.
En yaygın olarak kullanılan viral sistemler retrovirüs, lentivirüs, adenovirüs ve adeno-ilişkili virüs (AAV) dahildir <s> 11 kadar. Retrovirüsler, tek dallı bir RNA virüsleridir ve hedef hücre ve organ 12-14 transdüksiyona genlerin yaşam boyu ifadesi için potansiyel sağlamaktadır mitotik bölünmesi sırasında istikrarlı bir şekilde konukçu hücre genomuna genetik malzemenin neden olabilir. Bununla birlikte, retrovirüsler, çok çeşitli, sadece bölünen hücreleri enfekte eder ve bölünmeyen hücreleri onların etkinliği 15 derece düşüktür. Bu gen aktarımı için bunların kullanımını sınırlar. Lentivirüs Retroviridae ailesinin bir cinsidir. Diğer retrovirüsler arasında farklı, lentivirüs, her iki bölme ve bölünmeyen hücreleri enfekte edebilir ve yaygın olarak post-mitotik ve yüksek farklılaşmış hücrelerin 16 gen transferi için kullanılmıştır. Lentivirüs yaşam döngüsü, konakçı genomuna vektör DNA'nın entegrasyonu içermektedir. Bu nedenle, lentivirüs aracılığıyla gen teslimi transduse genetik elementlerin 16-18 kararlı ve uzun süreli ifadesini sağlar. Ancak, bu özellik bir çift e temsil edebilirVektör DNA 'nın entegrasyonu girmeyle mutagenez neden olabileceğinden, bu virüslerin kullanımı dged kılıcı gen ekspresyonunu değiştirmek için ve ev sahibi hücrelerde artefakt etkilere neden olabilir. Adenovirüs başka yaygın olarak kullanılan gen aktarım sistemidir. Retrovirüsler ve lentivirüsler farklı olarak, Adenovirüsler, entegre olmayan ve konakçı hücreler 8,10,11,19 genomik bütünlüğü ile karışmaz. Buna ek olarak, Adenovirüsler, bir çok hücre tipinde içine DNA transfekte olabilir ve enfeksiyon aktif hücre bölünmesi 19 bağlı değildir. Viral vektörler yeteneği 19,20 çoğaltılması zorunda adenovirüslerin başka önemli özelliği, vektör arınma kolaylığıdır. Bununla birlikte, bu sistemin en önemli uyarı adenovirüslerin, özellikle gen tedavisi çalışmalarında, birçok araştırmalarda kullanımını kısıtlayan, hedef hücrelerin ve organlar 19 güçlü bir bağışıklık tepkilerini tetikler olabilir.
Bu farklı tip ile karşılaştırıldığındaViral vektörlerin s, rekombinant adeno-bağlantılı virüs (AAV) ideal bir gen iletim sisteminin 21,22 olduğu görülmektedir. Minimal immünojenite ve patojenitesini 23,24 sergiler. Buna ek olarak, rAAV bölünmesi ve bölünmeyen hücreleri hem de dahil olmak üzere hücre tiplerinin geniş bir yelpazede enfekte eder. Çoğu durumda, rAAV ana genomlarına entegre değildir; Bu nedenle, hedef hücrelerde arzu genetik ya da genomik değişiklik riski düşüktür 22'dir.
Son zamanlarda, rAAV sistemleri başarıyla fare kalp kası 23,25-29, DNA kodlayan proteinlerin miRNA'lar, shRNAs ve CRISPR-gRNAs in vivo verilmesi için kullanılmaktadır. Bu metodoloji kardiyovasküler araştırma alanında temel araştırmalar ve gen tedavisi çalışmaları kolaylaştırmıştır. Burada detaylı bir işlemi etkin bir şekilde tarif edilmiştir aşın veya fare kalplerinde ilgi genleri demonte rAAV9 vektörleri üretir. Protokol, basit ve etkili bir yöntem temin etmektedirfare deneysel modellerde kalp gen ifadesi manipüle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Plazmid, inşaat sırasında istenmeyen ITR rekombinasyonu azaltmak için çok önemlidir. virüs oluşturmadan önce, bir zaman kısıtlaması sindirim ve agaroz jel elektroforezi kullanılarak AAV plazmid ITR bütünlüğünü izlemek gerekir. % 100 sağlam plazmidler elde etmek mümkün değildir, ancak rekombinasyon oranı mümkün olduğunca en aza indirilmelidir. Az% 20 başarı rAAV9 paket için kabul edilebilir. Dikkat çekici bir alt sallayarak hızla (180-200 rpm) ile düşük sıcaklıkta (30 ° C) bakteriler…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Zaffar Haque for careful reading of the manuscript. We thank Drs. Masaharu Kataoka and Gengze Wu for discussions and help. Work in the Wang lab is supported by the American Heart Association, Muscular Dystrophy Association, and NIH (HL085635, HL116919, HL125925).
Materials
| Polyethylenimine, Linear (MW 25,000) | Polysciences, Inc. | #23966-2 | |
| Tube, Polypropylene, 36.2 mL, 25 x 87 mm, (qty. 56) | Beckman Coulter, Inc | # 362183 | |
| Nuclease, ultrapure | SIGMA | #E8263-25KU | |
| Density Gradient Medium(Iodixanol) | SIGMA | #D1556-250ML | |
| Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD Millipore Corporation | #UFC910008 | |
| Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends,gauge 14, L 6 in., nickel plated hub | SIGMA | #CAD7942-12EA | |
| Poloxamer 188 solution (Pluronic® F-68 solution) | SIGMA | P5556-100ML | |
| Proteinase K | SIGMA | 3115828001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| DMEM medium | Fisher Scientific | SH30243FS | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| rAAV9 vector | Penn Vector Core | P1967 |
References
- Primrose, S. B., Twyman, R. . Principles of gene manipulation and genomics. , (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096 (2014).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat. Biotechnol. 32, 347-355 (2014).
- Szulc, J., Wiznerowicz, M., Sauvain, M. -. O., Trono, D., Aebischer, P. A versatile tool for conditional gene expression and knockdown. Nat. Methods. 3, 109-116 (2006).
- Nimesh, S., Halappanavar, S., Kaushik, N. K., Kumar, P. Advances in Gene Delivery Systems. BioMed Res. Int. 2015, 610342 (2015).
- Kamimura, K., Suda, T., Zhang, G., Liu, D. Advances in gene delivery systems. Pharm. Med. 25, 293-306 (2011).
- Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).
- Giacca, M., Zacchigna, S. Virus-mediated gene delivery for human gene therapy. J. Control Release. 161, 377-388 (2012).
- Witlox, M., Lamfers, M., Wuisman, P., Curiel, D., Siegal, G. Evolving gene therapy approaches for osteosarcoma using viral vectors: review. Bone. 40, 797-812 (2007).
- De Miguel, M. P., Cheng, L., Holland, E. C., Federspiel, M. J., Donovan, P. J. Dissection of the c-Kit signaling pathway in mouse primordial germ cells by retroviral-mediated gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 10458-10463 (2002).
- Nagano, M., Shinohara, T., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Retrovirus-mediated gene delivery into male germ line stem cells. FEBS Lett. 475, 7-10 (2000).
- Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 4626-4630 (1991).
- Katz, R. A., Greger, J. G., Skalka, A. M. Effects of cell cycle status on early events in retroviral replication. J. Cell. Biochem. 94, 880-889 (2005).
- Escors, D., Breckpot, K. Lentiviral vectors in gene therapy: their current status and future potential. Arch. Immunol. Ther. Exp. 58, 107-119 (2010).
- Mátrai, J., Chuah, M. K., VandenDriessche, T. Recent advances in lentiviral vector development and applications. Mol. Ther. 18, 477-490 (2010).
- Miyazaki, Y., Miyake, A., Nomaguchi, M., Adachi, A. Structural dynamics of retroviral genome and the packaging. Front. Microbiol. 2, 1-9 (2011).
- Douglas, J. T. Adenovirus-Mediated Gene Delivery. Gene Delivery to Mammalian Cells: Volume 2: Viral Gene Transfer Techniques. , 3-14 (2004).
- Armendáriz-Borunda, J., et al. Production of first generation adenoviral vectors for preclinical protocols: amplification, purification and functional titration. J. Biosci. Bioeng. 112, 415-421 (2011).
- Snyder, R. O. Adeno-associated virus-mediated gene delivery. J Gene Med. 1, 166-175 (1999).
- Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).
- Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene transfer in porcine myocardium after coronary infusion of an adeno-associated virus vector. Ann. Thorac. Surg. 62, 1669-1676 (1996).
- Kaspar, B. K., et al. Myocardial gene transfer and long-term expression following intracoronary delivery of adeno-associated virus. J. Gene. Med. 7, 316-324 (2005).
- Ding, J., et al. Trbp regulates heart function through microRNA-mediated Sox6 repression. Nat. Genet. 47, 776-783 (2015).
- Lin, Z., et al. Cardiac-specific YAP activation improves cardiac function and survival in an experimental murine MI model. Circ. Res. 115, 354-363 (2014).
- Wahlquist, C., et al. Inhibition of miR-25 improves cardiac contractility in the failing heart. Nature. 508, 531-535 (2014).
- Carroll, K. J., et al. A mouse model for adult cardiac-specific gene deletion with CRISPR/Cas9. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 113, 338-343 (2016).
- Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J., Seidman, C. E. Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy. Science. 342, 111-114 (2013).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6, 343-345 (2009).
- Rychlik, W., Spencer, W., Rhoads, R. Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro. Nucleic Acids Res. 18, 6409-6412 (1990).
- Allocca, M., et al. Serotype-dependent packaging of large genes in adeno-associated viral vectors results in effective gene delivery in mice. J. Clin. Invest. 118, 1955-1964 (2008).
- Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol. Ther. 18, 80-86 (2010).
- Li, J., Sun, W., Wang, B., Xiao, X., Liu, X. -. Q. Protein trans-splicing as a means for viral vector-mediated in vivo gene therapy. Hum. Gene Ther. 19, 958-964 (2008).
- Piras, B. A., O’Connor, D. M., French, B. A. Systemic delivery of shRNA by AAV9 provides highly efficient knockdown of ubiquitously expressed GFP in mouse heart, but not liver. PLoS One. 8, e75894 (2013).
- Lovric, J., et al. Terminal differentiation of cardiac and skeletal myocytes induces permissivity to AAV transduction by relieving inhibition imposed by DNA damage response proteins. Mol. Ther. 20, 2087-2097 (2012).
