Framställning av rAAV9 att överuttrycker eller Knockdown gener i Mus Hearts
Summary
In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.
Abstract
Kontrollera uttrycket eller aktiviteten av specifika gener genom hjärtmuskel leverans av genetiskt material i murina modeller medger undersökning av genfunktioner. Deras terapeutiska potential i hjärtat kan också bestämmas. Det finns begränsade metoder för in vivo molekylära ingrepp i musen hjärta. Rekombinant adenoassocierat virus (rAAV) -baserad genomet teknik har använts som ett viktigt verktyg för in vivo hjärt genmanipulation. De specifika fördelarna med denna teknik innefattar hög effektivitet, hög specificitet, låg genomisk takt integration, minimal immunogenicitet, och minimal patogenicitet. Här är en detaljerad beskrivning att konstruera, paket, och rena rAAV9 vektorer beskrivna. Subkutan injektion av rAAV9 in i neonatala valpar resulterar i robusta uttryck eller effektiv knockdown av genen (er) av intresse i mus hjärta, men inte i levern och andra vävnader. Med användning av hjärt-specific TnnT2 promotor, högt uttryck av GFP-genen i hjärtat erhölls. Dessutom riktar mRNA inhiberades i hjärtat när en rAAV9-U6-shRNA användes. Praktisk erfarenhet av rAAV9 teknik kan vara användbar för kardiovaskulära undersökningar.
Introduction
Styra uttryck eller aktivitet av specifika gener i olika biologiska system har blivit en värdefull strategi för att studera geners funktion 1. Ett direkt sätt att uppnå detta mål är att manipulera nukleotidsekvenser och generera mutanta alleler. Även göra exakta, målinriktade ändringar i genomet hos levande celler är fortfarande en tidsödande och arbetsintensiv praktiken har utvecklingen av kraftfulla talen och crispr / Cas9 verktyg öppnat en ny era av genomet redigering 2-5. En mer rutinlaboratoriemetod för genmanipulation har fokuserat på införandet av genetiska material (DNA och RNA som innehåller kodande sekvenser eller siRNA / shRNAs) in i cellerna för att uttrycka eller Knockdown genen (s) av intresse 1,6.
I många fall är det främsta hindret för genmanipulering är leverans av DNA, RNA eller protein i cellerna. När det gäller in vitro-studier, effektiv transfectipå system har etablerats i många odlade cellinjer. Men i musmodellen i synnerhet, är in vivo genavgivning mer utmanande. Det finns en serie av extra- och intracellulära barriärer som måste passeras för att uppnå effektiv cellulära upptaget av de exogena reagens. Ytterligare hinder är den snabba clearance och den korta varaktigheten av levererade material 7,8. En strategi för att kringgå dessa problem är att använda virala vektorer som "bärare" eller "fordon" för in vivo genleverans. De naturligt evolved transduktion egenskaper hos virus tillåta effektiv leverans av en gen av intresse in i celler 7,9,10. Många typer av virala vektorer har utvecklats och möjliggör en flexibel in vivo genmanipulation i olika celltyper och organ hos möss.
De mest allmänt använda virala system innefattar retrovirus, lentivirus, adenovirus och adeno-associerat virus (AAV) <supp> 11. Retrovirus är enkelsträngade RNA-virus och kan införa sitt genetiska material till värdcellsgenomet på ett stabilt sätt under mitotisk delning, vilket ger potentialen för livslångt expression av de transducerade gener i målcellerna och organ 12-14. Men många typer av retrovirus endast infekterar delande celler, och deras effektivitet i icke-delande celler är mycket låg 15. Detta begränsar deras användbarhet för genleverans. Lentivirus är ett släkte av Retroviridae familjen. Skiljer sig från andra retrovirus, lentivirus kan infektera både delande och icke-delande celler och har använts i stor utsträckning för genöverföring in efter mitotiska och högt differentierade celler 16. Livscykeln för Lentivirus även innebär integrering av vektor-DNA i värdgenomet. Således Lentivirus-medierad gentillförsel möjliggör stabil och långvarig uttryck av transducerade genetiska element 16-18. Emellertid kan denna funktion utgör en dubbel-edged svärd i användningen av dessa virus för att manipulera genuttryck, som integration av vektor-DNA kan leda till insertionsmutationer i värdcellerna och kan orsaka artefactual effekter. Adenovirus är en annan allmänt använd genavgivningssystemet. Till skillnad från retrovirus och lentivirus, Adenovirus är icke-integrerade och stör inte den genomiska integritet värdceller 8,10,11,19. Dessutom kan Adenovirus transfektera DNA i många celltyper, och infektion är inte beroende av aktiv celldelning 19. En annan viktig egenskap hos Adenovirus är den lätthet av vektor rening, i de virala vektorerna har förmågan att replikeras 19,20. Dock är den största nackdel med detta system att adenovirus-infektion kan utlösa starka immunsvar hos målceller och organ 19, som begränsar dess användning i många undersökningar, särskilt i genterapistudier.
Jämfört med dessa olika typs från virala vektorer, förefaller rekombinant adenoassocierat virus (rAAV) för att vara den idealiska genavgivningssystemet 21,22. Den uppvisar minimal immunogenicitet och patogenicitet 23,24. Dessutom rAAV infekterar ett brett spektrum av celltyper, inbegripet både delande och icke-delande celler. I de flesta fall, inte rAAV inte integreras i värdgenom; sålunda är risken för oönskade genetiska eller genomiska förändringar i målceller låg 22.
Nyligen har rAAV system med framgång använts för leverans av DNA som kodar för proteiner, miRNA, shRNAs och crispr-gRNAs in i mus-hjärtmuskeln 23,25-29 in vivo. Denna metod har underlättat grundläggande undersökningar och genterapistudier inom kardiovaskulär forskning. Här, till den detaljerade proceduren generera rAAV9 vektorer som effektivt överuttrycker eller Knockdown generna av intresse i mus hjärtan beskrevs. Protokollet ger en enkel och effektiv metod förmanipulera hjärt genuttryck i murina experimentella modeller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det är viktigt att minimera oönskad ITR rekombination under plasmidkonstruktion. Innan generering viruset, måste en alltid övervaka ITR integritet AAV-plasmider med användning av restriktionsdigerering och agarosgelelektrofores. Det är omöjligt att få 100% intakta plasmider, men rekombination förhållandet bör minimeras så mycket som möjligt. Mindre än 20% är acceptabel för framgångsrik rAAV9 förpackning. Notera kan odla bakterierna vid lägre temperatur (30 ° C) med en lägre skaka hastighet (180-200 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Zaffar Haque for careful reading of the manuscript. We thank Drs. Masaharu Kataoka and Gengze Wu for discussions and help. Work in the Wang lab is supported by the American Heart Association, Muscular Dystrophy Association, and NIH (HL085635, HL116919, HL125925).
Materials
| Polyethylenimine, Linear (MW 25,000) | Polysciences, Inc. | #23966-2 | |
| Tube, Polypropylene, 36.2 mL, 25 x 87 mm, (qty. 56) | Beckman Coulter, Inc | # 362183 | |
| Nuclease, ultrapure | SIGMA | #E8263-25KU | |
| Density Gradient Medium(Iodixanol) | SIGMA | #D1556-250ML | |
| Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD Millipore Corporation | #UFC910008 | |
| Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends,gauge 14, L 6 in., nickel plated hub | SIGMA | #CAD7942-12EA | |
| Poloxamer 188 solution (Pluronic® F-68 solution) | SIGMA | P5556-100ML | |
| Proteinase K | SIGMA | 3115828001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| DMEM medium | Fisher Scientific | SH30243FS | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| rAAV9 vector | Penn Vector Core | P1967 |
References
- Primrose, S. B., Twyman, R. . Principles of gene manipulation and genomics. , (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096 (2014).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat. Biotechnol. 32, 347-355 (2014).
- Szulc, J., Wiznerowicz, M., Sauvain, M. -. O., Trono, D., Aebischer, P. A versatile tool for conditional gene expression and knockdown. Nat. Methods. 3, 109-116 (2006).
- Nimesh, S., Halappanavar, S., Kaushik, N. K., Kumar, P. Advances in Gene Delivery Systems. BioMed Res. Int. 2015, 610342 (2015).
- Kamimura, K., Suda, T., Zhang, G., Liu, D. Advances in gene delivery systems. Pharm. Med. 25, 293-306 (2011).
- Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).
- Giacca, M., Zacchigna, S. Virus-mediated gene delivery for human gene therapy. J. Control Release. 161, 377-388 (2012).
- Witlox, M., Lamfers, M., Wuisman, P., Curiel, D., Siegal, G. Evolving gene therapy approaches for osteosarcoma using viral vectors: review. Bone. 40, 797-812 (2007).
- De Miguel, M. P., Cheng, L., Holland, E. C., Federspiel, M. J., Donovan, P. J. Dissection of the c-Kit signaling pathway in mouse primordial germ cells by retroviral-mediated gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 10458-10463 (2002).
- Nagano, M., Shinohara, T., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Retrovirus-mediated gene delivery into male germ line stem cells. FEBS Lett. 475, 7-10 (2000).
- Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 4626-4630 (1991).
- Katz, R. A., Greger, J. G., Skalka, A. M. Effects of cell cycle status on early events in retroviral replication. J. Cell. Biochem. 94, 880-889 (2005).
- Escors, D., Breckpot, K. Lentiviral vectors in gene therapy: their current status and future potential. Arch. Immunol. Ther. Exp. 58, 107-119 (2010).
- Mátrai, J., Chuah, M. K., VandenDriessche, T. Recent advances in lentiviral vector development and applications. Mol. Ther. 18, 477-490 (2010).
- Miyazaki, Y., Miyake, A., Nomaguchi, M., Adachi, A. Structural dynamics of retroviral genome and the packaging. Front. Microbiol. 2, 1-9 (2011).
- Douglas, J. T. Adenovirus-Mediated Gene Delivery. Gene Delivery to Mammalian Cells: Volume 2: Viral Gene Transfer Techniques. , 3-14 (2004).
- Armendáriz-Borunda, J., et al. Production of first generation adenoviral vectors for preclinical protocols: amplification, purification and functional titration. J. Biosci. Bioeng. 112, 415-421 (2011).
- Snyder, R. O. Adeno-associated virus-mediated gene delivery. J Gene Med. 1, 166-175 (1999).
- Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).
- Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene transfer in porcine myocardium after coronary infusion of an adeno-associated virus vector. Ann. Thorac. Surg. 62, 1669-1676 (1996).
- Kaspar, B. K., et al. Myocardial gene transfer and long-term expression following intracoronary delivery of adeno-associated virus. J. Gene. Med. 7, 316-324 (2005).
- Ding, J., et al. Trbp regulates heart function through microRNA-mediated Sox6 repression. Nat. Genet. 47, 776-783 (2015).
- Lin, Z., et al. Cardiac-specific YAP activation improves cardiac function and survival in an experimental murine MI model. Circ. Res. 115, 354-363 (2014).
- Wahlquist, C., et al. Inhibition of miR-25 improves cardiac contractility in the failing heart. Nature. 508, 531-535 (2014).
- Carroll, K. J., et al. A mouse model for adult cardiac-specific gene deletion with CRISPR/Cas9. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 113, 338-343 (2016).
- Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J., Seidman, C. E. Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy. Science. 342, 111-114 (2013).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6, 343-345 (2009).
- Rychlik, W., Spencer, W., Rhoads, R. Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro. Nucleic Acids Res. 18, 6409-6412 (1990).
- Allocca, M., et al. Serotype-dependent packaging of large genes in adeno-associated viral vectors results in effective gene delivery in mice. J. Clin. Invest. 118, 1955-1964 (2008).
- Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol. Ther. 18, 80-86 (2010).
- Li, J., Sun, W., Wang, B., Xiao, X., Liu, X. -. Q. Protein trans-splicing as a means for viral vector-mediated in vivo gene therapy. Hum. Gene Ther. 19, 958-964 (2008).
- Piras, B. A., O’Connor, D. M., French, B. A. Systemic delivery of shRNA by AAV9 provides highly efficient knockdown of ubiquitously expressed GFP in mouse heart, but not liver. PLoS One. 8, e75894 (2013).
- Lovric, J., et al. Terminal differentiation of cardiac and skeletal myocytes induces permissivity to AAV transduction by relieving inhibition imposed by DNA damage response proteins. Mol. Ther. 20, 2087-2097 (2012).
