إعداد الثقافات الدبقية المختلطة الابتدائية من الكبار ماوس النخاع الشوكي الأنسجة
Summary
تطوير ألم الاعتلال العصبي وتشمل التغيرات المرضية للخلايا الحبل الشوكي الدبقية. نظام الثقافة الدبقية موثوقة مستمدة من أنسجة الحبل الشوكي الكبار ومصممة لدراسة هذه الخلايا في المختبر غير متوفرة. لذلك، نعرض هنا كيفية تأسيس الثقافات الدبقية المختلطة الابتدائية من الماوس الكبار نسيج الحبل الشوكي.
Abstract
وقد تم قبول جيدا أن الحبل الشوكي الردود الدبقية تساهم بشكل كبير في تطوير ألم الأعصاب. وقد تم الحصول على معلومات هائلة فيما يتعلق بأنشطة الدبقية على المستويات الخلوية والجزيئية من خلال المختبر في أنظمة زراعة الخلايا. نظم في المختبر تستخدم، وتشمل أساسا الدبقية الأولية المستمدة من الأنسجة القشرية الدماغ حديثي الولادة وخلد خطوط الخلايا. ومع ذلك، قد لا يعكس هذه النظم خصائص خلايا الحبل الشوكي الدبقية في الجسم الحي. من أجل مواصلة التحقيق في أدوار خلايا الحبل السري الدبقية العمود الفقري في تطوير الأعصاب الطرفية ألم الأعصاب الاصابة التي يسببها استخدام نظام الثقافة التي تعكس على نحو أفضل حالة في الجسم الحي، وقد وضعت لدينا مختبر طريقة لوضع الحبل الشوكي الأساسي الثقافات الدبقية مختلطة من فئران بالغة. لفترة وجيزة، يتم جمع النخاع الشوكي من فئران بالغة ومعالجتها من خلال الهضم غراء تليها إزالة المايلين مع أوكارإيتي-التدرج المتوسطة. تعليق خلية واحدة يتم تربيتها في كامل Dulbecco وسائل الإعلام النسر المعدلة (cDMEM) تستكمل مع 2-المركابتويثانول (2-ME) في 35.9 درجة مئوية. تم تحسين هذه الظروف والثقافة خصيصا لنمو الخلايا الدبقية مختلطة. في ظل هذه الظروف، الخلايا جاهزة لاستخدامها في التجارب بين 12-14 د (خلايا وعادة ما تكون في مرحلة سجل خلال هذا الوقت) بعد تأسيس ثقافة (D 0)، ويمكن أن تبقى في ظروف ثقافة تصل إلى D 21. هذا النظام الثقافة يمكن استخدامها لتحقيق استجابات خلايا الحبل الشوكي الدبقية على التحفيز مع مختلف المواد والوكلاء. إلى جانب ألم الأعصاب، وهذا النظام يمكن استخدامه لدراسة الاستجابات الدبقية في غيرها من الأمراض التي تنطوي على التغيرات المرضية للخلايا الحبل الشوكي الدبقية.
Introduction
الألم المزمن هو مشكلة صحية خطيرة تؤثر على ما يقرب من 100 مليون من البالغين في الولايات المتحدة، مع تكلفة سنوية تقديرية تصل إلى 635000000000 $ 1. وقد أشارت أدلة متزايدة على مساهمة كبيرة من خلايا الحبل الشوكي الدبقية في تطوير ألم الأعصاب، واحدة من أكثر أنواع المدمرة للألم المزمن 2. ومن شأن في المختبر نظام الثقافة السليم يساعد بشكل كبير في مواصلة التحقيق في دور الخلايا الدبقية على المستويات الخلوية والجزيئية.
حاليا، في المختبر أنظمة ثقافة الدبقية تستخدم من قبل الباحثين وتشمل الخلايا الدبقية أساسا مشتقة من الأنسجة القشرية من الأطفال حديثي الولادة الماوس أو الفئران العقول وتخليد خطوط الخلايا الدبقية مشتقة من الماوس حديثي الولادة أو خلايا الفئران الدبقية الأولية. خلايا حديثي الولادة تحتوي على أعداد كبيرة من خلايا غير متمايزة التي يمكن زيادة متباينة في الخلايا الدبقية (خاصة الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة)، وبالتالي توفيرخلايا bundant للاستخدام التجريبي 3. ومع ذلك، فقد أظهرت دراستنا السابقة أن الأطفال حديثي الولادة الدماغ الخلايا الدبقية استجابت بشكل ملحوظ مختلفة من خلايا الحبل الشوكي الدبقية الكبار على lipopolysaccharide في (LPS) التحفيز. على سبيل المثال، انترلوكين (IL) -4 المعروضة تعزيز الآثار المثبطة على أكسيد النيتريك التي يسببها LPS (NO) الإنتاج في الفئران البالغين الدبقية الحبل الشوكي مقارنة مع الأطفال حديثي الولادة الدبقية في الدماغ 4. وعلاوة على ذلك، لمحات من إنتاج chemokine على التحفيز من قبل نيوروبيبتيدي، الكالسيتونين الببتيد ذات الصلة الجين (CGRP)، تختلف بلا شك بين الماوس حديثي الولادة الدبقية في الدماغ (الطرق الموضحة في المرجع 5) والفأر الشوكي الكبار الدبقية الحبل (الشكل 1). خطوط الخلايا أنشئت هي سهلة الاستخدام والحفاظ على ويمكن أن توفر عدد كبير من الخلايا في فترة زمنية قصيرة. بشكل عام، خلد يتم إنشاء خطوط الخلايا إما باستخدام نظام تخليد بوساطة فيروس (مثل خط خلية دبقية تستخدم على نطاق واسع BV2) 6 أو 7 أو عشر التاليةتحديد البريد التحول التلقائي (مثل خط خلية نجمية C8-D1A وخط خلية دبقية C8-B4) 8، 9 خطوط خلية ممتازة في دراسة خصائص الجزيئية الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة بشكل فردي؛ ومع ذلك، فإن النتائج التي تم الحصول عليها من خطوط الخلايا تتطلب دائما مزيدا من التحقق من الصحة في الخلايا الأولية أو في ظروف في الجسم الحي. كما ينبغي الإشارة إلى أنه لم يكن هناك تقرير من خط الخلايا الدبقية التي مشتق من الدبقية الحبل الشوكي القوارض.
للمساعدة في التحقيق في دور خلايا الحبل السري الدبقية العمود الفقري في تطوير ألم الأعصاب، ونظام الثقافة التي مشتق من الحبل الشوكي الماوس الكبار تم تطويرها من قبل التكيف مع طريقة ذكرت سابقا يستخدم لتوليد فأر بالغ مختلطة الثقافات الدبقية 4، 5 وقد تم صقل ثقافة الدبقية الماوس الحبل الشوكي مزيد مؤخرا 10 ويوصف في مزيد من التفاصيل في هذه المقالة. الكبار الحبل الشوكي مختلطة الثقافات الدبقية جوتنشأ مع ماوس من السلالات المختارة التي تتناسب مع احتياجات دراسة معينة، ويمكن الحفاظ على الخلايا في الثقافة لمدة تصل إلى 21 د الرد على الشروع في الثقافة. يمكن استخدام هذا الأسلوب في الدراسات ألم الأعصاب، وكذلك في التحقيقات من مختلف الأمراض العصبية التي تنطوي على تغييرات مرضية داخل الحبل الشوكي، مثل التصلب الضموري الجانبي (ALS)، وفيروس نقص المناعة البشرية (HIV) -associated الاعتلال العصبي الحسي، ومتعددة التصلب (MS).
Protocol
Representative Results
Discussion
ومن الأهمية بمكان تنفيذ جميع الخطوات، بما في ذلك وسائل الإعلام تغيير جدول بطريقة متسقة من أجل الحصول على نتائج استنساخه بين التجارب. الخطوات التالية هي الحاسمة ولا سيما في الحصول على نوعية ممتازة الكبار الدبقية مختلطة.
عملية اله…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Adult spinal cord mixed cultures were first developed using rats with grant support from an NIH/NIDA R01 award (PI De Leo) and an NIH T32 training grant (PI Green). These methods were further adapted for mouse spinal cords with support from the following grants: NIH/NIDA 5K01DA023503 (PI Cao), NIH/NINDS 5R21NS066130 (PI Cao), and NIH/NIGMS P20GM103643 (PI Meng). The authors would also like to thank Dr. Alejandro M. S. Mayer, Department of Pharmacology, Chicago College of Osteopathic Medicine, for his technical help in obtaining microglia-rich mixed glial cells.
Materials
| Dulbecco’s modification of Eagle’s media (DMEM) with 4.5g/L glucose | Lonza | 12-709F | The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researcher can decide where to purchase the DMEM and all other component used to make cDMEM media. |
| L-Glutamine (100x) | Lonza | 17-605E | The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researcher can decide where to purchase L-glutamine. |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) | Corning-Mediatech | 30-004-CI | This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/ml penicillin G, 10 mg/ml streptomycin sulfate and 25 µg/ml amphotericin B. Individual researcher can decide where to purchase individual component. |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | Sigma-Aldrich | M3148 | A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis. |
| Papain dissociation system | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | Individual components of this kit can be purchased separately. |
| Percoll | GE Health Care | 17-0891-01 | Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed. |
| Lab-line incubator/shaker | Barstead/Lab-line | MaxQ4000 | This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead. |
| Lipopolysaccharides, Salmonella Minnesota Re595 | Sigma-Aldrich | L-9764 | Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses may vary. |
| Mouse IL-6 DuoSet ELISA | R&D Systems | DY406 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA | R&D Systems | DY410 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA | R&D Systems | DY466 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set | BD Biosciences | 555260 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse chemokine Q-Plex | Quansys Biosciences | 120251MS | This product was available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis. |
| APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11) | eBioscience | 17-0451 | Antibody of the same clone but from other vendors can be used. |
| FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 11-0112 | Antibody of the same clone but from other vendors can be used. |
| Accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | BD Accuri C6 | Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers. |
| FlowJo software | Tree Star, Inc. | FlowJo7.6.5 | Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers. |
References
- Gaskin, D. J., Richard, P. The economic costs of pain in the United States. J Pain. 13 (8), 715-724 (2012).
- Ji, R. R., Berta, T., Nedergaard, M. Glia and pain: Is chronic pain a gliopathy?. Pain. 154 (01), S10-S28 (2013).
- Ni, M., Aschner, M., Maines, M. D. Neonatal rat primary icroglia: isolation, culturing and selected applications. Curr Protoc Toxicol. , (2010).
- Cao, L., Fei, L., Chang, T. T., DeLeo, J. A. Induction of interleukin-1beta by interleukin-4 in lipopolysaccharide-treated mixed glial cultures: microglial-dependent effects. J Neurochem. 102 (2), 408-419 (2007).
- Malon, J. T., Maddula, S., Bell, H., Cao, L. Involvement of calcitonin gene-related peptide and CCL2 production in CD40-mediated behavioral hypersensitivity in a model of neuropathic pain. Neuron Glia Biol. 7 (2-4), 117-128 (2011).
- Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf / v-myc carrying retrovirus. J Neuroimmunol. 27 (2), 229-237 (1990).
- Bocchini, V., et al. An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells. J Neurosci Res. 31 (4), 616-621 (1992).
- Alliot, F. O., Marty, M. C., Cambier, D., Pessac, B. A spontaneously immortalized mouse microglial cell line expressing CD4. Dev Brain Res. 95 (1), 140-143 (1996).
- Alliot, F. O., Pessac, B. Astrocytic cell clones derived from established cultures of 8-day postnatal mouse cerebella. Brain Res. 306 (1-2), 283-291 (1984).
- Malon, J. T., et al. Microglial content-dependent inhibitory effects of calcitonin gene-related peptide (CGRP) on murine retroviral infection of glial cells. J Neuroimmunol. 279, 64-70 (2015).
- Cao, L., DeLeo, J. A. CNS Infiltrating CD4(+) T lymphocytes Contribute to Murine Spinal Nerve Transection-Induced Neuropathic Pain. Eur J Immunol. 38 (2), 448-458 (2008).
- Mayer, A. M., et al. Effect of a short-term in vitro exposure to the marine toxin domoic acid on viability, tumor necrosis factor-alpha, matrix metalloproteinase-9 and superoxide anion release by rat neonatal microglia. BMC Pharmacol. 1, 7 (2001).
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
- Rock, R. B., et al. Role of Microglia in Central Nervous System Infections. Clin Microbiol Rev. 17 (4), 942-964 (2004).
- Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. The Role of Microglia in Central Nervous System Immunity and Glioma Immunology. J Clin Neurosci. 17 (1), 6-10 (2010).
