성인 마우스 척수 조직에서 차 혼합 폐해 문화의 준비
Summary
신경 병성 통증의 개발 척수 신경교 세포의 병리학 적 변화를 수반한다. 시험관 내에서 이들 세포를 공부 성인 척수 조직으로부터 유래 설계된 신뢰성 신경교 배양 시스템이 부족하다. 따라서, 우리는 성인 마우스 척수 조직에서 차 혼합 된 아교 문화를 설정하는 방법을 여기에 표시됩니다.
Abstract
척수 신경교 반응은 신경 병증 통증의 발전에 크게 기여하는 것이 잘 인정되었다. 세포 및 분자 수준에서 신경교 활동에 대한 상당한 정보를 시험 관내 세포 배양 시스템을 통해 얻어진다. 사용 된 시험 관내 시스템은 주로 신생아의 뇌 피질 조직으로부터 유도 된 일차 신경교 포함 및 세포주 불멸. 그러나, 이러한 시스템은 생체 내에서 척수 신경교 세포의 특성을 반영하지 않을 수있다. 더 나은 생체 상태를 반영 배양 시스템을 이용하여 말초 신경 손상 – 유도 된 신경 병증 통증의 개발 척수 신경교 세포의 역할을 조사하기 위해, 우리 실험실에서 기본 척수 혼합 신경교 배양을 설정하는 방법을 개발했다 성인 마우스. 간단히, 척수는 성인 쥐에서 수집하고 굴과 수초 제거하여 파파인 소화를 통해 처리됩니다성만 구배 매체. 단일 세포 현탁액은 35.9 오 ℃에서 2- 머 캅토 에탄올 (2-ME) 보충 완전한 둘 베코의 변형 이글 미디어 (cDMEM)에서 배양 이러한 배양 조건은 혼합 아교 세포의 성장을 위해 특별히 최적화된다. 이러한 조건 하에서, 셀 (12) 사이의 실험에 사용될 준비가 – 14 일 배양의 설립 (D 0) 후 (셀이 기간 동안 로그 단계에서 일반적 임) 및 D (21)까지의 배양 조건에서 유지 될 수있다. 이 배양 시스템은 다양한 물질 및 제제로 자극시 척수 신경교 세포의 반응을 조사하기 위해 사용될 수있다. 신경 병성 통증 외에,이 시스템은 척수 신경교 세포의 병리학 적 변화를 포함하는 다른 질병의 폐해 반응을 연구하는데 사용될 수있다.
Introduction
만성 통증은 최대 $ (635) 10 억의 추정 연간 비용으로, 미국에서 약 1 억 성인에 영향을 미치는 심각한 건강 문제이다. 증거 확보는 신경 병증 통증, 만성 통증이 가장 파괴 한 가지의 개발 척수 신경교 세포의 상당한 기여를 표시하고있다. 적절한 시험 관내 배양 시스템은 세포 및 분자 수준에서 신경교 세포의 역할을 조사 크게 도움이 될 것이다.
현재 연구에서 사용되는 시험 관내 신경교 배양 시스템은 신생아 마우스 또는 쥐의 뇌 피질 조직 유래 주로 아교 세포를 포함하는 불멸화 및 신생아 마우스로부터 유도 된 아교 세포주 또는 일차 신경교 세포를 쥐. 신생아 세포 따라서를 제공, 추가 (주로 성상 세포 및 미세 아교 세포) 신경 교세포로 분화 할 수있는 미분화 세포의 큰 숫자를 포함실험 사용 3 bundant 세포. 그러나, 우리의 이전 연구는 신생아의 뇌 신경 교세포는 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) 자극에 성인 척수 아교 세포에서 크게 다르게 반응 것으로 나타났습니다. 예를 들면, 인터루킨 (IL)는 -4 신생아의 뇌 신경교 4 비교 성숙한 래트 척수에서 신경교 (NO)의 생산 LPS 유도 된 산화 질소에 대한 억제 효과를 강화 표시됩니다. 또한, 유전자 관련 펩타이드 (CGRP) 칼시토닌 신경 펩티드에 의한 자극에 따라 케모카인 생산의 프로파일은, (5. 참고 문헌에 기술 된 방법) 신생 마우스의 뇌 신경교 사이 말할 나위 다른 성인 마우스 척수 신경교 (도 1). 확립 된 세포주를 사용 및 유지 관리가 용이하고 단시간에 다수의 셀을 제공 할 수있다. 일반적으로, 세포주를 생성하거나 6, 7, 또는 다음의 제 (예 널리 사용 소교 세포주 BV2 등) 바이러스 – 매개 불멸화 시스템을 사용하는 불멸화자발 변환의 전자 식별 (예 성상 세포주 C8-D1A 및 소교 세포주 C8-B4)를 8, 9 세포주 개별적 성상 세포 및 미세 아교 세포의 분자 적 특징을 연구하는데 우수하다.; 그러나, 세포주에서 얻어진 결과는 항상 주요 세포 또는 생체 내 조건에서의 추가 확인을 요구한다. 또한 설치류의 척수 아교에서 유래하는 아교 세포주 보고서가 없었던 것을 주목해야한다.
신경 병증 성 통증, 성인 쥐 혼합 신경교 배양 (4)를 생성하는 데 사용되는 이전에보고 된 방법을 적용하여 개발 된 성인 마우스 척수로부터 유래 배양 시스템 (5)의 개발 척수 신경교 세포의 역할을 조사하는 데 도움 . 마우스 척수 폐해 문화는 더 최근에 (10)를 정제하고,이 문서에 자세히 설명되어 있습니다. 성인 척수 혼합 폐해 문화의 C는 특정 연구의 요구에 맞게 선택된 균주로부터 마우스를 확립하고, 세포를 배양 개시 게시 d는 최대 21 명까지 배양 유지할 수있다. 이 방법뿐만 아니라 -associated 근 위축성 측삭 경화증 (ALS), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 감각 신경 병증, 복수 등의 척수 내 병리학 적 변화를 포함하는 다양한 신경 질환의 연구에서, 신경병 통증의 연구에 사용될 수있다 경화증 (MS).
Protocol
Representative Results
Discussion
는 모든 단계를 포함한 실험 간 재현성있는 결과를 얻기 위해 일관된 방식으로 일정 변화 매체를 수행하는 것이 중요하다. 다음 단계는 우수한 품질의 성인 혼합 된 아교 세포를 얻기에 특히 중요하다.
효소 소화는이 프로토콜의 중요한 측면이다. 이 조직 조각을 단일 세포 현탁액을 얻기 위해서 잘 소화하는 것이 중요하다. 그러나, 오버 소화 상당히 적은 세포에서 발생합니…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Adult spinal cord mixed cultures were first developed using rats with grant support from an NIH/NIDA R01 award (PI De Leo) and an NIH T32 training grant (PI Green). These methods were further adapted for mouse spinal cords with support from the following grants: NIH/NIDA 5K01DA023503 (PI Cao), NIH/NINDS 5R21NS066130 (PI Cao), and NIH/NIGMS P20GM103643 (PI Meng). The authors would also like to thank Dr. Alejandro M. S. Mayer, Department of Pharmacology, Chicago College of Osteopathic Medicine, for his technical help in obtaining microglia-rich mixed glial cells.
Materials
| Dulbecco’s modification of Eagle’s media (DMEM) with 4.5g/L glucose | Lonza | 12-709F | The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researcher can decide where to purchase the DMEM and all other component used to make cDMEM media. |
| L-Glutamine (100x) | Lonza | 17-605E | The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researcher can decide where to purchase L-glutamine. |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) | Corning-Mediatech | 30-004-CI | This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/ml penicillin G, 10 mg/ml streptomycin sulfate and 25 µg/ml amphotericin B. Individual researcher can decide where to purchase individual component. |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | Sigma-Aldrich | M3148 | A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis. |
| Papain dissociation system | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | Individual components of this kit can be purchased separately. |
| Percoll | GE Health Care | 17-0891-01 | Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed. |
| Lab-line incubator/shaker | Barstead/Lab-line | MaxQ4000 | This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead. |
| Lipopolysaccharides, Salmonella Minnesota Re595 | Sigma-Aldrich | L-9764 | Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses may vary. |
| Mouse IL-6 DuoSet ELISA | R&D Systems | DY406 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA | R&D Systems | DY410 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA | R&D Systems | DY466 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set | BD Biosciences | 555260 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse chemokine Q-Plex | Quansys Biosciences | 120251MS | This product was available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis. |
| APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11) | eBioscience | 17-0451 | Antibody of the same clone but from other vendors can be used. |
| FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 11-0112 | Antibody of the same clone but from other vendors can be used. |
| Accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | BD Accuri C6 | Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers. |
| FlowJo software | Tree Star, Inc. | FlowJo7.6.5 | Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers. |
References
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