Préparation de cultures mixtes gliales primaires de souris adultes Spinal Cord Tissue
Summary
Le développement de la douleur neuropathique implique des changements pathologiques des cellules gliales cordon de la colonne vertébrale. Un système de culture gliale fiable provenant d' un tissu de la moelle épinière adulte et conçu pour l' étude de ces cellules in vitro est absente. Par conséquent, nous montrons ici comment établir cultures primaires gliales mixtes de souris adultes tissu de la moelle épinière.
Abstract
Il a été bien accepté que les réponses gliales de la moelle épinière contribuent de manière significative au développement de la douleur neuropathique. Informations énormes concernant les activités de gliales aux niveaux cellulaires et moléculaires a été obtenue grâce à des systèmes in vitro de culture cellulaire in. Les systèmes in vitro utilisés, comprennent principalement des cellules gliales primaires dérivées de tissu cérébral néonatal cortical et des lignées cellulaires immortalisées. Toutefois, ces systèmes peuvent ne pas refléter les caractéristiques des cellules gliales cordon spinaux in vivo. Afin d'étudier plus avant le rôle des cellules de cordon gliales spinaux dans le développement de nerf périphérique blessures induites par la douleur neuropathique en utilisant un système de culture qui reflète mieux la condition in vivo, notre laboratoire a mis au point une méthode pour établir la moelle épinière primaire cultures gliales mixtes de souris adultes. En bref, la moelle épinière sont collectées à partir des souris adultes et traitées par digestion papaïne suivie de l'élimination de la myéline avec un tanièreslité-gradient moyen. Des suspensions de cellules simples sont cultivées dans un support Eagle modifié Dulbecco complet (cDMEM) additionné de 2-mercaptoéthanol (2-ME) à 35,9 ° C. Ces conditions de culture sont optimisées spécifiquement pour la croissance des cellules gliales mélangées. Dans ces conditions, les cellules sont prêtes à être utilisées pour l'expérimentation de 12 – 14 J (cellules sont généralement en phase logarithmique pendant ce temps) après la mise en place de la culture (D 0) et peuvent être conservés dans des conditions de culture jusqu'à D 21. ce système de culture peut être utilisé pour étudier les réponses des cellules gliales épinière de la colonne vertébrale lors d'une stimulation avec différentes substances et agents. En plus de la douleur neuropathique, ce système peut être utilisé pour étudier les réponses gliales dans d'autres maladies qui impliquent des changements pathologiques des cellules gliales du cordon médullaire.
Introduction
La douleur chronique est un problème de santé grave qui touche environ 100 millions d' adultes aux États-Unis, avec un coût annuel estimé de jusqu'à 635 milliards $ 1. Preuves de montage a indiqué une contribution significative des cellules gliales cordon de la colonne vertébrale dans le développement de la douleur neuropathique, l' un des types les plus dévastateurs de la douleur chronique 2. Un système in vitro de culture approprié dans contribuerait de manière significative dans les enquêtes davantage les rôles des cellules gliales aux niveaux cellulaires et moléculaires.
Actuellement, les systèmes de culture in vitro de gliales utilisées par les chercheurs comprennent principalement des cellules gliales provenant de tissus corticaux de souris ou de rat nouveau – nés et les cerveaux des lignées cellulaires immortalisées dérivées de cellules gliales souris ou rat néonatal des cellules gliales primaires. néonatale cellules contiennent un nombre important de cellules non différenciées qui peuvent encore être différenciées en cellules gliales (astrocytes et la microglie principalement), fournissant ainsi uncellules bundant pour l' utilisation expérimentale 3. Cependant, notre étude antérieure a montré que les cellules gliales du cerveau du nouveau-né ont réagi de manière significative différemment des cellules gliales du cordon sur la moelle épinière adulte lipopolysaccharide (LPS) de stimulation. Par exemple, l' interleukine (IL) -4 affichée améliorée des effets inhibiteurs sur l' oxyde nitrique induite par le LPS (NO) chez le rat adulte moelle épinière glie par rapport au cerveau du nouveau – né glie 4. En outre, les profils de la production de chimiokines lors d'une stimulation par un neuropeptide, la calcitonine gene-related peptide (CGRP), sont incontestablement différent entre le cerveau glie de souris néonatale (méthodes décrites dans la réf. 5) et une souris adulte moelle glie épinière (figure 1). des lignées cellulaires établies sont faciles à utiliser et à entretenir, et peuvent fournir un grand nombre de cellules dans un court laps de temps. En général, les lignées cellulaires immortalisées sont générées soit à l' aide d' un système d'immortalisation à médiation par un virus ( par exemple, la lignée de cellules microgliales BV2 largement utilisé) , 6, 7 ou suivant el' identification du courrier de transformation spontanée ( par exemple, la lignée cellulaire d'astrocytes en C8-D1A et la lignée cellulaire microgliale en C8-B4) , 8, 9 lignées cellulaires sont excellents en étudiant les caractéristiques moléculaires des astrocytes et la microglie individuellement. cependant, les résultats obtenus à partir des lignées cellulaires nécessitent toujours une validation supplémentaire dans des cellules primaires ou dans des conditions in vivo. Il convient également de noter qu'il n'y a pas eu un rapport d'une lignée de cellules gliales qui est dérivé d'un glie de la moelle épinière rongeur.
Pour aider à étudier le rôle des cellules de cordon gliales spinaux dans le développement de la douleur neuropathique, un système de culture qui est dérivée de la moelle épinière de souris adulte a été développé en adaptant une méthode précédemment rapporté utilisé pour générer rat adulte cultures gliales mixtes 4, 5 . La culture gliale de souris de la moelle épinière a également été récemment affinée 10 et est décrite plus en détail dans cet article. Adulte cordon mélangé colonne vertébrale cultures gliales cun être établi avec une souris à partir de souches sélectionnées qui correspondent aux besoins de l'étude particulière, et les cellules peuvent être maintenues en culture pendant jusqu'à 21 jours post début de la culture. Cette méthode peut être utilisée dans les études de la douleur neuropathique, ainsi que dans les enquêtes de diverses maladies neurologiques qui impliquent des changements pathologiques de la moelle épinière, tels que la sclérose latérale amyotrophique (SLA), le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) -Associated neuropathie sensorielle et multiple la sclérose en plaques (SEP).
Protocol
Representative Results
Discussion
Il est essentiel d'effectuer toutes les étapes, y compris les médias changer le calendrier dans une manière cohérente afin d'obtenir des résultats reproductibles entre les expériences. Les étapes suivantes sont particulièrement critiques pour obtenir une excellente adulte de qualité glie mixte.
La digestion enzymatique est un aspect important de ce protocole. Il est crucial que les morceaux de tissu sont bien digérée afin d'obtenir une suspension cellulaire unique. Cep…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Adult spinal cord mixed cultures were first developed using rats with grant support from an NIH/NIDA R01 award (PI De Leo) and an NIH T32 training grant (PI Green). These methods were further adapted for mouse spinal cords with support from the following grants: NIH/NIDA 5K01DA023503 (PI Cao), NIH/NINDS 5R21NS066130 (PI Cao), and NIH/NIGMS P20GM103643 (PI Meng). The authors would also like to thank Dr. Alejandro M. S. Mayer, Department of Pharmacology, Chicago College of Osteopathic Medicine, for his technical help in obtaining microglia-rich mixed glial cells.
Materials
| Dulbecco’s modification of Eagle’s media (DMEM) with 4.5g/L glucose | Lonza | 12-709F | The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researcher can decide where to purchase the DMEM and all other component used to make cDMEM media. |
| L-Glutamine (100x) | Lonza | 17-605E | The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researcher can decide where to purchase L-glutamine. |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) | Corning-Mediatech | 30-004-CI | This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/ml penicillin G, 10 mg/ml streptomycin sulfate and 25 µg/ml amphotericin B. Individual researcher can decide where to purchase individual component. |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | Sigma-Aldrich | M3148 | A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis. |
| Papain dissociation system | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | Individual components of this kit can be purchased separately. |
| Percoll | GE Health Care | 17-0891-01 | Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed. |
| Lab-line incubator/shaker | Barstead/Lab-line | MaxQ4000 | This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead. |
| Lipopolysaccharides, Salmonella Minnesota Re595 | Sigma-Aldrich | L-9764 | Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses may vary. |
| Mouse IL-6 DuoSet ELISA | R&D Systems | DY406 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA | R&D Systems | DY410 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA | R&D Systems | DY466 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set | BD Biosciences | 555260 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse chemokine Q-Plex | Quansys Biosciences | 120251MS | This product was available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis. |
| APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11) | eBioscience | 17-0451 | Antibody of the same clone but from other vendors can be used. |
| FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 11-0112 | Antibody of the same clone but from other vendors can be used. |
| Accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | BD Accuri C6 | Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers. |
| FlowJo software | Tree Star, Inc. | FlowJo7.6.5 | Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers. |
References
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