Utarbeidelse av Primary Mixed Glial kulturer fra Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Summary

Utviklingen av nevropatisk smerte innebærer patologiske forandringer av ryggmargs gliaceller. En pålitelig glial kultursystem avledet fra voksen ryggmarg vev og utformet for å studere disse cellene in vitro mangler. Derfor viser vi her hvordan etablere primær blandede gliaceller kulturer fra voksen mus ryggmarg vev.

Abstract

Det har blitt godt akseptert at ryggmargs gliaceller responser bidra vesentlig til utviklingen av nevropatisk smerte. Enorm informasjon om gliaceller aktiviteter på de cellulære og molekylære nivå er oppnådd gjennom in vitro cellekultursystemer. In vitro-systemer benyttes, omfatter hovedsakelig primær gliaceller avledet fra neonatal hjerne kortikal vev og foreviget cellelinjer. Imidlertid kan disse systemene ikke reflekterer egenskapene til ryggmargen gliacellene in vivo. For ytterligere å undersøke rollene til ryggmargen gliaceller i utviklingen av perifer nerveskade-indusert nevropatisk smerte ved hjelp av en kultur system som bedre gjenspeiler in vivo tilstand, har vårt laboratorium utviklet en metode for å etablere primærryggmargs blandede glia kulturer fra voksne mus. Kort fortalt er ryggmargen hentet fra voksne mus og behandlet gjennom papain fordøyelsen etterfulgt av myelin fjerning med hiligheten-gradient medium. Enkeltcellesuspensjoner blir dyrket i fullstendig Dulbeccos modifiserte Eagle medium (cDMEM) supplert med 2-merkaptoetanol (2-ME) ved 35,9 ^o C. Disse kulturbetingelser ble optimalisert for vekst av blandede gliaceller. Under disse betingelser, cellene er klar til å brukes for eksperimentering mellom 12 – 14 d (celler er vanligvis i logaritmisk fase i løpet av denne tid) etter etableringen av kulturen (D 0) og kan holdes i kulturbetingelser opp til D-21. denne kulturen systemet kan brukes til å undersøke responsene fra ryggmargen gliaceller ved stimulering med forskjellige substanser og agenter. Dess nevropatisk smerte, kan dette system brukes til å studere glial responser i andre sykdommer som involverer patologiske forandringer av ryggmargs gliaceller.

Introduction

Kronisk smerte er et alvorlig helseproblem som rammer ca 100 millioner voksne i USA, med en estimert årlig kostnad på opp til $ 635 000 000 000 ^1. Monterings bevis har antydet et betydelig bidrag av ryggmargs gliaceller i utviklingen av nevropatisk smerte, en av de mest ødeleggende typer kronisk smerte ^2. En skikkelig in vitro kultur system ville hjelpe betraktelig i ytterligere undersøke rollene gliacellene på cellulære og molekylære nivåer.

For tiden er in vitro gliaceller dyrkingssystemer som brukes av forskere omfatter hovedsakelig gliaceller avledet fra kortikale vev av nyfødte mus eller rottehjerner og udødelig glial cellelinjer avledet fra neonatal mus eller rotte primære gliaceller. Neonatale celler inneholder et betydelig antall udifferensierte celler som kan bli ytterligere differensieres til gliaceller (hovedsakelig astrocytter og mikroglia), for således å tilveiebringe enbundant celler for eksperimentell bruk ^tre. Imidlertid har vår tidligere studie vist at neonatal hjerne gliacellene svarte signifikant forskjellig fra voksne ryggmargs gliacellene på lipopolysakkarid (LPS) stimulering. For eksempel, interleukin (IL) -4 vises forbedret inhiberende effekt på LPS-indusert nitrogenoksid (NO) produksjon i voksen rotte ryggmarg gliaceller i forhold til neonatale hjerne gliaceller ^4. Videre profiler av chemokin-produksjon ved stimulering av et nevropeptid, kalsitonin-relatert peptid (CGRP), er unarguably forskjellig mellom nyfødt musehjerne gliaceller (metoder som er beskrevet i Ref. 5) og voksne mus ryggmarg gliaceller (figur 1). Etablerte cellelinjer er lett å bruke og vedlikeholde, og kan tilveiebringe et stort antall celler i en kort tidsperiode. Generelt, udødeliggjort cellelinjer genereres enten ved hjelp av et virus-mediert immortalisering system (slik som den mest utbredte microglial cellelinje BV2) ^{6, 7} eller følgende the identifikasjon av spontan transformasjon (for eksempel astrocytt cellelinje C8-D1a og microglial cellelinje C8-B4) ^{8, 9} cellelinjer er utmerket i å studere de molekylære egenskaper av astrocytter og mikroglia hver for seg.; men de oppnådde resultatene fra cellelinjer krever alltid ytterligere validering i primærceller eller in vivo forhold. Det bør også bemerkes at det ikke har vært en rapport av en glial cellelinje som er avledet fra en gnager ryggmarg gliaceller.

For å bidra til å undersøke rollen til ryggmargs gliaceller i utviklingen av nevropatisk smerte, et kultursystem som er avledet fra den voksne mus ryggmargen er utviklet ved å tilpasse en tidligere rapportert fremgangsmåte som brukes til å generere en voksen rotte blandede glial kulturer ^{4, 5} . musen ryggmarg glial kulturen ble ytterligere raffinert nylig ¹⁰ og er beskrevet i mer detalj i denne artikkelen. Voksen ryggmargs blandet glia kulturer cet etableres med en mus fra utvalgte stammer som passer til behovene til den spesielle undersøkelse, og cellene kan bli opprettholdt i kultur i opp til 21 d legge initiering av kulturen. Denne fremgangsmåten kan anvendes i nevropatisk smerte studier, samt i undersøkelser av forskjellige neurologiske sykdommer som involverer patologiske endringer i ryggmargen, slik som amyotrofisk lateral sklerose (ALS), humant immunsviktvirus (HIV) -associated sensorisk neuropati og multippel sklerose (MS).

Protocol

Følgende protokoll ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Universitetet i New England. Følgende protokoll er for å forberede gliaceller kulturer fra fire voksne mus ryggmargen. 1. Utarbeidelse av løsninger i en kultur Hood under aseptiske forhold Forbered vekstmedium: komplett Dulbeccos modifikasjon av Eagle medier (cDMEM) som inneholder DMEM (med 4,5 g / l glukose), 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 IE / ml penicillin, 100 mg …

Representative Results

Denne fremgangsmåte kan anvendes for å fremstille blandede gliaceller fra både mus og rotter. Den gjennomsnittlige totale celleantall per brønn i en 12-brønn plate på D 12 etter initiering av kulturen skal være forholdsvis stabile, med rundt 100.000 celler per brønn når cellene er avledet fra mus ryggmargen. Gliaceller hentet fra denne metoden kan brukes i eksperimenter som er utviklet for å undersøke voksen ryggmargs gliaceller reaksjoner ved administrering av stoffer og stof…

Discussion

Det er viktig å utføre alle trinnene-, inkludert mediene skiftende tidsplan-på en konsekvent måte for å oppnå reproduserbare resultater mellom eksperimenter. Følgende trinn er spesielt kritisk i å få god kvalitet voksen mixed gliaceller.

Enzymatisk nedbrytning er et viktig aspekt ved denne protokollen. Det er viktig at vevet bitene er godt spaltet for å oppnå en enkel cellesuspensjon. Imidlertid vil over fordøyelsen resultere i betydelig færre celler. Hver lab trenger for å utf…

Materials

Dulbecco’s modification of Eagle’s media (DMEM) with 4.5g/L glucose	Lonza	12-709F	The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researcher can decide where to purchase the DMEM and all other component used to make cDMEM media.
L-Glutamine (100x)	Lonza	17-605E	The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researcher can decide where to purchase L-glutamine.
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)	Corning-Mediatech	30-004-CI	This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/ml penicillin G, 10 mg/ml streptomycin sulfate and 25 µg/ml amphotericin B. Individual researcher can decide where to purchase individual component.
2-mercaptoethanol (2-ME)	Sigma-Aldrich	M3148	A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis.
Papain dissociation system	Worthington Biochemical Corporation	LK003150	Individual components of this kit can be purchased separately.
Percoll	GE Health Care	17-0891-01	Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed.
Lab-line incubator/shaker	Barstead/Lab-line	MaxQ4000	This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead.
Lipopolysaccharides, Salmonella Minnesota Re595	Sigma-Aldrich	L-9764	Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses may vary.
Mouse IL-6 DuoSet ELISA	R&D Systems	DY406	Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA	R&D Systems	DY410	Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA	R&D Systems	DY466	Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set	BD Biosciences	555260	Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse chemokine Q-Plex	Quansys Biosciences	120251MS	This product was available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis.
APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11)	eBioscience	17-0451	Antibody of the same clone but from other vendors can be used.
FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70)	eBioscience	11-0112	Antibody of the same clone but from other vendors can be used.
Accuri C6 flow cytometer	BD Biosciences	BD Accuri C6	Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers.
FlowJo software	Tree Star, Inc.	FlowJo7.6.5	Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers.