신경 화학적 마커에 대한 Biocytin 충전 및 가공 섹션의 면역 염색
Summary
이 프로토콜은 biocytin 충전 및 후속 면역 후 처리를 사용하여 전기 생리 녹음하는 동안 패치 신경 세포의 형태 학적 복구를위한 방법을 제시한다. 우리는 염색 coverslipped 된 두꺼운 biocytin 채워진 부분은 나중에 두 번째 차 항체 일 개월 restained 될 수 있음을 보여줍니다.
Abstract
패치 클램프 기술을 이용하여 세포의 전기 생리 학적 기록 소성 패턴에 따라 다른 유형의 연결의 식별을 허용했다. 기록 전극의 biocytin / neurobiotin의 포함은 수지상 arborization 및 기록 된 신경 세포의 축삭의 대상 지역을 결정하는 데 필요한 형태 세부 사항의 사후 복구를 허용합니다. 그러나, 별개의 신경 화학적 정체성과 기능, 세포 형 특정 단백질에 대한 면역 조직 화학 염색과 형태 학적으로 유사한 신경 세포의 존재 주어진 결정적으로 신경 세포를 식별하는 데 필수적이다. 네트워크 연결성을 유지하기 위해, 기록 용 생리 뇌 절편을 300㎛ 이상의 두께로 제조된다. 그러나,이 두께는 종종 조직의 resectioning을 필요로 인해 항체 침투 문제에 면역 조직 후 처리를 방해한다. 조각의 Resectioning 종종 있습니다 END_STRONG_1, 도전적인 예술이다조직 및 세포 형태의 손실이 팅되는 전기 생리 데이터를 사용할 수 없게 된 데이터를 렌더링을 얻었다. 신경 마커의 선택에서의 데이터 손실과 가이드를 제한 할 형태의 복구 이후, 우리는 보조 면역이어서 제 1 셀 형태를 회수하는 전략을 채택 하였다. 우리는 생리 녹음 및 신경 화학적 정체성을 결정하는 섹션의 restaining 다음 형태의 회복에 대한 후속 직렬 면역 염색 동안 충전 biocytin하는 실용적인 접근 방식을 소개합니다. 우리는 (PFA) 파라 포름 알데히드로 고정 스테인드 및 coverslipped biocytin으로 가득 차 있었다 섹션을 제거하고 나중에 두 번째 차 항체 일에 restained 될 수 있음을보고한다. 이 restaining은 커버 슬립을 제거, 완충액 섹션 세정 및 신경 화학적 신원을 공개하는 일차 및 이차 항체의 배양을 수반한다. 상기 방법은 DAT를 제거하는 것이 유리하다형태를 복구 할 수 없기 때문 및 신경 화학적 마커를 좁혀에 대한 손실은 형태에 따라 시험한다.
Introduction
뇌는 개별의 연결 요소의 구조적 및 기능적 특성의 다양성 알려져있다. 뇌 기능과 병리에 뚜렷한 신경 세포 유형의 역할을 이해하는 것은 특성화 및 신경 세포의 명확한 식별이 필요합니다. 축삭 arborization의 패턴이 잠재적 인 시냅스 대상을 식별하는 동안 구조적으로, somato-수지상 위치에 의해 정의 된 형태 학적 특징은, 특정 신경 세포가받는 잠재적 입력을 결정합니다. 신경 세포의 구조적 다양성은 라몬 Y Cajal의 정액 조직 학적 연구 1 일부터 평가되고있다. 단일 셀에 기록하는 기술의 출현은 구조적으로 구별되는 신경 또한 소성 패턴 및 시냅스 특성의 차이를 보여주는 것으로 나타났다. 구조와 생리의 다양성은 GABA 성 억제 신경 2,3에 특히 분명하다. 또한, structurall 것이 점차 명백되었다Y 유사한 신경 기능의 차이 4 해당하는 다른 신경 화학적 마커와 쇼를 표현할 수 있습니다. 마찬가지로, 동일한 신경 화학적 마커 뉴런은 별개의 구조와 기능 5-10을 가질 수 있습니다. 따라서, 실제로, 네트워크 내의 뉴런의 기능적 특성 분석 및 그들의 역할은 두 형태 학적 및 신경 화학적 ID를 정의 수반한다. 비록 특정 신경 화학적 마커 타겟팅 리포터 마우스 라인의 출현으로는 면역 조직학 (11)에 기초하여 형태 및 하위 유형 식별을 결정하는 것이 필요하다.
급성 뇌 조각에 기록 된 세포의 특성을하는 데 사용되는 표준 방법은 녹화 중에 biocytin 또는 neurobiotin로 채우기 녹음 다음 파라 포름 알데히드의 섹션 (PFA)를 해결하고, 형태 및 신경 화학을 나타 내기 위해 면역 조직 화학 염색을 사용하는 것입니다. 슬라이스 생리학에 대한 부분의 두께 때문에 300 μm의는 전형적으로대부분의 항체는 그 깊이 끝까지 관통하지 이상, 때문에 또는, 조각 및 신경 화학적 biocytin 마커 12-14 동시 면역 있도록 60 ㎛ 이하로 다시 구분 될 필요가있다. 불행하게도, resectioning는 힘든이다 절편 동안 조직의 손실 위험; 및 형태 학적 재구성을 복잡하게, 조직의 수축을 차동으로 이어질 수 있습니다. 또한, 형태에 대한 사전 지식은 세포에 의해 표현 될 가능성이 후보 마커를 좁힐 수 있습니다. 우리는 첫 번째 형태의 복구를 위해 다음 잠재적 인 신경 화학적 마커의 식별 섹션의 시리얼 처리 할 수 있도록 표준 biocytin 면역 조직학 프로토콜을 수정했습니다.
면역 조직은 조직 또는 세포 항원 분포 연구이며, 효소, 형광 라벨, 방사성 원소, 금 콜로이드 입자 (15)를 이용하여 가시화 될 수있다. 프로 시저 전특히 시각화 차 항체를 표적 형광 이차 항체를 이용하여 다음에 하나 이상의 특정 항원 태그와 증폭 차 항체를 사용하여 nvolves. 오버랩없이 각각의 이차 항체의 형광 스펙트럼을 구별 할 필요성으로 인해, 항원의 제한된 수를 동시에 검사 할 수있다. 따라서, 형태의 사전 지식은 세포 분류에 대한 후보 신경 화학적 마커를 선택하는데 도움이 될 수 있습니다. 개념적으로, 이미 묻은 부분의 직렬 처리 뒤에 이론적 근거는 하나의 단백질 또는 펩티드에 대한 immunolabeling하는 것은 구조적으로 독립적 인 펩티드 (16)에 대한 항원 및 후속 immunolabeling을 방해해서는 안 전제에 기초한다. 간섭의 결여는 항원의 특정 단백질 에피토프에 대한 항체의 결합에 기인하고, 따라서 동일한 조직에서 여러 항원의 동시 염색을 허용한다. 항원의 수 reveale면역 염색에 의한 D는 형광 이차 항체의 비 중첩 스펙트럼에 대한 필요성에 의해 교차 – 반응성 (17, 18)을 제거하기 위해 다른 종에서 발생하는 개별 항체 항원을 표적 할 필요성에 의해 제한된다. 이 마운트 부에 하나 이상의 항원 immunolabeling 완료 후보고되지 않은 초 항원에 대한 면역 염색, 우리의 지식에 상호 작용할 수있는 두 가지 항체 직렬 아닌 동시 라벨 뒤에 추론된다. 여기서는 미리 염색 장착 섹션 직렬 면역 염색하는 방법을 설명한다. 우리가 상세히 두꺼운 부분 단백질 / 펩티드 마커 염색 하였다 형태의 복구를위한 직렬 immunolabeling 과정이 공정 동안 동일한 절차가 얇은 부분뿐만 아니라 조직 학적 기준에 사용될 수있다. 또한, 우리는 biocytin하고을 제거하는 공정에 기록 된 뉴런을 채우기 위해 실용적인 접근 방식을 설명최근 우리의 작업 6,8-에서 제시된 바와 같이 기록이 완료되면 전지에서 전극의 축색 뉴런의 수지상 아버의 충전을 최적화한다.
여기에 기재된 절차의 가장 중요한 장점은, 기록 셀의 형태가 완전히 회수 절제술 또는 슬라이스 발현 사이 전에 이미징 될 수 있다는 것이다. 특정 항체의 침투에 문제가 차 면역을위한 절제 슬라이스가 필요 없게 될 수도 있지만, 여기에 설명 된 절차는 여러 부분에서 복잡한 뉴런을 재구성 할 필요를 제거 할 재건을 손상 할 수있는 조직의 감량 및 차등 수축으로 인한 문제를 방지 할 resectioning를 다음과 같습니다. 추가 장점은 공정이 면역 및 biocytin 채워진 뉴런 회수되는 슬라이스 재 절편을 제한함으로써 비용, 시간, 노력 및 비용이 항체를 줄일 수 있다는 것이다. 가장 실용적인 목적은 광고입니다전술 한 기술을 사용하여 이전 섹션 염색 개월에 수행 될 수 ditional 면역. 특히, 형태의 회복이 현저하게 세포로부터 생리적 데이터 인해 셀 타입의 기본적인 형태 학적 특성을 얻을 수 없기으로 폐기되도록 전위를 감소시킨다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜 내에서 중요한 단계
biocytin으로 패치 된 셀을 작성하는 형태의 완전한 복구를 보장 할 수있는 가장 중요한 단계입니다. 셀의 전체 복구를 들어, 슬라이싱하는 동안 프로세스의 절단을 최소화하는 최적의 슬라이스 방향을 선택하는 것이 필수적이다. 이 방향은 시험중인 회로 및 세포 유형에 따라 다를 수 있습니다. 다음으로, 상기 biocytin가 축삭 돌기 및 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 VS.에 NIH / NINDS R01 NS069861 및 NJCBIR CBIR14IRG024의 지원을 인정하고 싶습니다
Materials
| NaCl | Sigma | S7653 | Immunostaining |
| KCL | Fluka | 60129 | Immunostaining |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | Immunostaining |
| KH2PO4 | Sigma | 229806 | Immunostaining |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Immunostaining |
| Guinea pig anti CB1 | Sigma | Af530-1 | Immunostaining |
| Mouse anti CCK | CURE, UCLA | courtesy of G. Ohning | Immunostaining |
| Rabbit anti Parvalbumin | Swant | PV27 | Immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor conjugate | Molecular Probes | S11227 | Immunostaining |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | Immunostaining |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Immunostaining |
| Secondary Antibodies | Invitogen Molecular probes | Alexa Fluor conjugated dyes | Immunostaining |
| Labnet orbit low speed shaker | Bioexpress | S-2030-LS | Immunostaining |
| Forceps | Dumont | 11231-30 | Immunostaining |
| Slide folders | EMS | 71520 | Immunostaining |
| Vibratome VT 1200 S | Leica | 14048142066 | Electrophysiology |
| Multiclamp 700B amplifier | Molecular devices | Multiclamp 700B | Electrophysiology |
| pCLAMP 10 Software | Molecular devices | pCLAMP 10 | Electrophysiology |
| Digitizer | Molecular Devices | Digidata 1440 digitizer | Electrophysiology |
| Filter tips | Nalgene | 171-0020 | Electrophysiology |
| Sonicator | Fisher Scientific | 15-335-100 | Electrophysiology |
| Microloaders | Eppendorf | 930001007 | Electrophysiology |
| Biocytin | Sigma | B4261 | Electrophysiology |
References
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