Иммуноокрашивание Biocytin заполненных и переработанным секций для нейрохимических маркеров
Summary
Этот протокол представляет собой метод морфологического восстановления нейронов исправленных во время электрофизиологических записей с использованием наполнения biocytin и последующего иммуногистохимического постобработки. Покажем, что толстые секции biocytin заполненные которые окрашивали и покрывали могут быть restained со вторым первичных дней антител или месяцев спустя.
Abstract
Электрофизиологические записи клеток с использованием метода патч зажим позволили для идентификации различных типов нейронов, основанных на образцах стрельбы. Включение biocytin / neurobiotin в записи электрода позволяет ретроспективном восстановление морфологических деталей, которые необходимы для определения ветвления дендритов и регионы, ориентированные на аксонов записанных нейронов. Однако, учитывая наличие морфологически сходных нейронов с различными нейрохимических идентичностей и функции, иммуногистохимическое окрашивание для белков клеточного типа конкретных важно, чтобы окончательно определить нейроны. Для поддержания подключения к сети, срезы головного мозга для физиологических записей готовят при толщине 300 мкм или больше. Тем не менее, эта толщина часто мешает иммуногистохимического постобработку из-за проблем с проникновением антител, что требует резекции ткани. Резекции срезов является сложным искусством, часто Ресултин в потере ткани и морфологии клеток, из которых электрофизиологические данные были получены, рендеринг данных непригодным для использования. Поскольку восстановление морфологии ограничит потери данных и руководство в выборе нейрональных маркеров, мы приняли стратегию восстановления морфологии клеток первого, а затем вторичным иммунным окрашиванием. Введем практический подход к biocytin наполнения во время физиологических записей и последующего серийного иммунным окрашиванием для восстановления морфологии, с последующим restaining участков для определения нейрохимических идентичности. Мы сообщаем, что участки, которые были заполнены с biocytin нелетучие с параформальдегидом (ПФА), окрашивали и покрывали могут быть удалены и restained со второй первичной дней антитела позже. Это restaining включает в себя удаление покровного, промывка секций в буферном растворе, и инкубацию первичных и вторичных антител выявить нейрохимических идентичность. Метод является предпочтительным для устранения ДАТпотери из-за невозможности восстановления морфологии и сужения нейрохимические маркеры для тестирования на основе морфологии.
Introduction
Мозг известен разнообразием в структурных и функциональных характеристик отдельных его элементов нейрональных. Понимание роли различных типов нейронов в функции мозга и патологии требует определения характеристик и однозначной идентификации нейронов. Конструктивно, морфологические признаки, определяемые сомато-дендритной месте определить потенциальные входы, которые получает данный нейрон, в то время как модель аксонов разветвление выявляет потенциальные постсинаптические цели. Структурное разнообразие нейронов была оценена со времен семенных гистологических исследований Рамона Кахаль в 1. Появление методов записи одноклеточных показало, что структурно различные нейроны также показывают различия в характере обжига и синаптических характеристик. Разнообразие в структуре и физиологии особенно проявляется в ГАМКергических тормозных нейронов 2,3. Кроме того, она становится все более очевидным, что конструкционнаяу аналогичные нейроны могут выражать различные нейрохимические маркеры и показать соответствующие функциональные 4 различия. Точно так же, нейроны с теми же нейрохимических маркеров могут иметь различные структуры и функции 5-10. Таким образом, на практике, анализ функциональных характеристик нейронов и их роли в сети влечет за собой устанавливает их морфологические и нейрохимические идентичностей. Даже с появлением репортерных мышей линий , ориентированных на конкретные нейрохимические маркеры, часто бывает необходимо определить морфологию и идентичность подтипа основана на иммуногистологии 11.
Стандартный метод, используемый для характеристики клеток, записанные в острых срезах мозга, чтобы наполнить их biocytin или neurobiotin во время записи, фиксации секций в параформальдегида (PFA) следующие записи, а также использовать иммуногистохимии для выявления морфологии и нейрохимические. Так как толщина секций для среза физиологии, как правило, 300 мкмили более, и потому , что большинство антител не проникают полностью через эту глубину, кусочки должны быть повторно разрезали до 60 мкм или менее , чтобы обеспечить одновременное иммуногистохимическое biocytin и нейрохимических маркеров 12-14. К сожалению, это трудоемкий резекции; риски потери ткани во время секционирования; и может привести к неравномерная усадка ткани, усложняя морфологическими реконструкций. Кроме того, предварительное знание морфологии может помочь сузить маркеры кандидатов, которые могут быть выражены клетками. Мы модифицировали стандартные протоколы biocytin Иммуногистология, чтобы позволить последовательной обработке секций первого для восстановления морфологии, а затем для идентификации потенциальных нейрохимических маркеров.
Иммуногистохимия является изучение распределения антигенов в тканях или клетках и могут быть визуализированы с использованием фермента, флуоресцентные метки, радиоактивные элементы или частицы золота коллоидных 15. Процедура яnvolves с использованием первичных антител, специфически метит и усиливать один или более специфических антигенов, с последующим использованием флуоресцентных вторичных антител, направленных первичное антитело для визуализации. Из-за необходимости различать спектры флуоресценции каждого вторичного антитела не перекрывали друг друга, только ограниченное количество антигенов, могут быть рассмотрены одновременно. Таким образом, предварительное знание морфологии может быть полезным при выборе кандидата нейрохимические маркеры для классификации клеток. Концептуально, Обоснованием последовательной обработке уже окрашенных участков основана на предпосылке , что иммунноокрашивания для одного белка или пептида , не должны мешать антигенных свойств и последующей иммунноокрашивания для структурно – независимого пептида 16. Это отсутствие помех из-за связывания антител к специфическим белком эпитопом на антигене, и, следовательно, позволяет одновременно окрашивании нескольких антигенов в той же ткани. Количество антигенов revealed иммунным окрашиванием ограничена необходимостью неперекрывающихся спектров флуоресцентных вторичных антител и необходимостью неадресный антигенов с антителами , индуцированными у разных видов , с тем чтобы устранить перекрестную реактивность 17,18. В то время как это рассуждение позади последовательного, а не одновременного мечения с двумя различными антителами, которые могут взаимодействовать, насколько нам известно, иммуногистохимическое второго антигена не сообщалось после завершения иммунноокрашивания для одного или нескольких антигенов на смонтированных участках. Здесь мы опишем метод последовательного иммунным ранее окрашенных и смонтированных секций. В то время как мы подробно этот процесс последовательной процедуры иммунноокрашивания для восстановления морфологии с последующим окрашиванием на белок / пептидных маркеров в толстых секций, одни и те же процедуры могут быть использованы в стандартных, тонкие гистологические срезы, а также. Кроме того, мы опишем практический подход, чтобы заполнить записанные нейроны с biocytin и процессом вытеснитьэлектрода из клетки после завершения записи , чтобы оптимизировать заполнение аксонов и дендритных беседок нейронов, как это представлено в нашей недавней работе 6,8.
Самым важным преимуществом способа, описанного здесь, является то, что морфология записанном клетки могут быть полностью восстановлены и отображены перед попыткой резекции или immunostain ломтиков. Хотя проблемы с проникновением определенных антител может сделать необходимым резекция срезах для вторичного иммунным окрашиванием, процедуры, подробно здесь устранит необходимость перестройки сложных нейронов из нескольких секций, и позволит избежать проблем из-за потери ткани и дифференциальной усадки, которая может поставить под угрозу восстановление Следующий резекции. Дополнительным преимуществом является то, что процесс приведет к сокращению затрат, времени, усилий и дорогостоящих антител путем ограничения иммуноокрашивания и повторно секционирования на ломтики, в котором восстанавливаются biocytin заполненные нейроны. Наиболее практичным аспектом является объявлениеНАЯ иммунное, которые могут быть выполнены на срезах, окрашенных месяцев перед использованием вышеупомянутой методики. В частности, восстановление морфологии бы значительно уменьшить потенциал, что физиологические данные из клеток, отвергнутых из-за невозможности получить базовый уровень морфологическую характеристику типа клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические шаги в рамках Протокола
Заполнение исправленной клетки с biocytin является наиболее важным шагом для обеспечения полного восстановления морфологии. Для полного восстановления клетки, важно, чтобы выбрать оптимальную ориентацию среза, чтобы …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы отметить поддержку со стороны NIH / NINDS R01 NS069861 и NJCBIR CBIR14IRG024 к VS.
Materials
| NaCl | Sigma | S7653 | Immunostaining |
| KCL | Fluka | 60129 | Immunostaining |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | Immunostaining |
| KH2PO4 | Sigma | 229806 | Immunostaining |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Immunostaining |
| Guinea pig anti CB1 | Sigma | Af530-1 | Immunostaining |
| Mouse anti CCK | CURE, UCLA | courtesy of G. Ohning | Immunostaining |
| Rabbit anti Parvalbumin | Swant | PV27 | Immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor conjugate | Molecular Probes | S11227 | Immunostaining |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | Immunostaining |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Immunostaining |
| Secondary Antibodies | Invitogen Molecular probes | Alexa Fluor conjugated dyes | Immunostaining |
| Labnet orbit low speed shaker | Bioexpress | S-2030-LS | Immunostaining |
| Forceps | Dumont | 11231-30 | Immunostaining |
| Slide folders | EMS | 71520 | Immunostaining |
| Vibratome VT 1200 S | Leica | 14048142066 | Electrophysiology |
| Multiclamp 700B amplifier | Molecular devices | Multiclamp 700B | Electrophysiology |
| pCLAMP 10 Software | Molecular devices | pCLAMP 10 | Electrophysiology |
| Digitizer | Molecular Devices | Digidata 1440 digitizer | Electrophysiology |
| Filter tips | Nalgene | 171-0020 | Electrophysiology |
| Sonicator | Fisher Scientific | 15-335-100 | Electrophysiology |
| Microloaders | Eppendorf | 930001007 | Electrophysiology |
| Biocytin | Sigma | B4261 | Electrophysiology |
References
- Garcia-Lopez, P., Garcia-Marin, V., Freire, M. The histological slides and drawings of cajal. Front Neuroanat. 4, 9 (2010).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
- Petilla Interneuron Nomenclature, G., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
- Armstrong, C., Soltesz, I. Basket cell dichotomy in microcircuit function. J Physiol. 590 (4), 683-694 (2012).
- Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells. PLoS One. 8 (8), e70553 (2013).
- Gupta, A., Elgammal, F. S., Proddutur, A., Shah, S., Santhakumar, V. Decrease in tonic inhibition contributes to increase in dentate semilunar granule cell excitability after brain injury. J Neurosci. 32 (7), 2523-2537 (2012).
- Fish, K. N., Hoftman, G. D., Sheikh, W., Kitchens, M., Lewis, D. A. Parvalbumin-containing chandelier and basket cell boutons have distinctive modes of maturation in monkey prefrontal cortex. J Neurosci. 33 (19), 8352-8358 (2013).
- Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate cannabinoid-sensitive interneurons undergo unique and selective strengthening of mutual synaptic inhibition in experimental epilepsy. Neurobiol Dis. 89, 23-35 (2016).
- Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate total molecular layer interneurons mediate cannabinoid-sensitive inhibition. Hippocampus. 25 (8), 884-889 (2015).
- Varga, C., et al. Functional fission of parvalbumin interneuron classes during fast network events. Elife. 3, (2014).
- Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age. Neural Circuits Revealed. , 109 (2015).
- Krook-Magnuson, E., Luu, L., Lee, S. H., Varga, C., Soltesz, I. Ivy and neurogliaform interneurons are a major target of mu-opioid receptor modulation. J Neurosci. 31 (42), 14861-14870 (2011).
- Szabadics, J., Soltesz, I. Functional specificity of mossy fiber innervation of GABAergic cells in the hippocampus. J Neurosci. 29 (13), 4239-4251 (2009).
- Iball, J., Ali, A. B. Endocannabinoid Release Modulates Electrical Coupling between CCK Cells Connected via Chemical and Electrical Synapses in CA1. Front Neural Circuits. 5, 17 (2011).
- Chen, X., Cho, D. -. B., Yang, P. -. C. Double staining immunohistochemistry. N Am J Med Sci. 2 (5), 241-245 (2010).
- Ranjan, A. K., et al. Cellular detection of multiple antigens at single cell resolution using antibodies generated from the same species. Journal of immunological. 379 (1), 42-47 (2012).
- Fuccillo, D. A., Sever, J. L. . Concepts in Viral Pathogenesis II. , 324-330 (1986).
- Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting. Acta Histochem. 107 (2), 143-148 (2005).
- Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and morphological characterization of neuronal microcircuits in acute brain slices using paired patch-clamp recordings. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (95), e52358 (2015).
- Walz, W. . Patch-clamp analysis : advanced techniques. 2nd edn. , (2007).
- Molnar, P. . Patch-clamp methods and protocols. 403, (2007).
- Martina, M., Taverna, S. . Patch-clamp methods and protocols. , (2014).
- Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons). J Vis Exp. (91), e51706 (2014).
- Jinno, S., Kosaka, T. Immunocytochemical characterization of hippocamposeptal projecting GABAergic nonprincipal neurons in the mouse brain: a retrograde labeling study. Brain research. 945 (2), 219-231 (2002).
- Yu, J., Proddutur, A., Swietek, B., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Functional Reduction in Cannabinoid-Sensitive Heterotypic Inhibition of Dentate Basket Cells in Epilepsy: Impact on Network Rhythms. Cereb Cortex. , (2015).
- Proddutur, A., Yu, J., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Seizure-induced alterations in fast-spiking basket cell GABA currents modulate frequency and coherence of gamma oscillation in network simulations. Chaos. 23 (4), 046109 (2013).
- Scharfman, H. E. Differentiation of rat dentate neurons by morphology and electrophysiology in hippocampal slices: granule cells, spiny hilar cells and aspiny ‘fast-spiking’ cells. Epilepsy Res Suppl. 7, 93-109 (1992).
- Tasker, J. G., Hoffman, N. W., Dudek, F. E. Comparison of three intracellular markers for combined electrophysiological, morphological and immunohistochemical analyses. J Neurosci Methods. 38 (2-3), 129-143 (1991).
