La inmunotinción de las secciones llenas de Biocitina y se procesaron para neuroquímicos Marcadores
Summary
Este protocolo presenta un método para la recuperación morfológica de las neuronas parcheado durante registros electrofisiológicos usando llenado biocitina y posterior procesamiento posterior inmunohistoquímico. Se demuestra que las secciones biocitina llenas de gruesos que se tiñeron y se pueden coverslipped restained con un segundo anticuerpo primario días o meses más tarde.
Abstract
Los registros electrofisiológicos de células por medio de la técnica de patch clamp han permitido la identificación de los diferentes tipos neuronales basados en patrones de descarga. La inclusión de biocitina / neurobiotin en el electrodo de registro permite la recuperación post-hoc de los detalles morfológicos, que son necesarios para determinar la arborización dendrítica y las regiones seleccionadas por los axones de las neuronas registradas. Sin embargo, dada la presencia de neuronas morfológicamente similares con las identidades y funciones neuroquímicas distintas, la tinción inmunohistoquímica de las proteínas de células de tipo específico es esencial para identificar definitivamente las neuronas. Para mantener la conectividad de la red, las secciones del cerebro para las grabaciones fisiológicas se preparan con un grosor de 300 micras o mayor. Sin embargo, este espesor a menudo dificulta el posprocesamiento inmunohistoquímico debido a problemas con la penetración de anticuerpos, lo que requiere la resección del tejido. Resección de las rebanadas es un arte difícil, a menudo Resulting en la pérdida de tejido y la morfología de las células de las que se obtuvo datos electrofisiológicos, haciendo que los datos inutilizable. Dado que la recuperación de la morfología limitaría la pérdida de datos y la guía en la selección de marcadores neuronales, hemos adoptado una estrategia de recuperación de la morfología celular primero, seguido de inmunotinción secundaria. Se introduce un enfoque práctico para biocitina llenando durante los registros fisiológicos y inmunotinción siguiente de serie para la recuperación de la morfología, seguido por el restaining de las secciones para determinar la identidad neuroquímico. Nos informan de que las secciones que estaban llenos de biocitina, fijadas con paraformaldehído (PFA), manchadas, y coverslipped se pueden quitar y restained con un segundo anticuerpo primario días posteriores. Este restaining consiste en la eliminación del cubreobjetos, el lavado de las secciones en una solución tampón, y la incubación de los anticuerpos primarios y secundarios para revelar la identidad neuroquímico. El método es ventajoso para la eliminación de datuna pérdida debido a la imposibilidad de recuperar la morfología y de la reducción a los marcadores neuroquímicos a ensayar sobre la base de la morfología.
Introduction
El cerebro es conocida por la diversidad en las características estructurales y funcionales de sus elementos neuronales individuales. La comprensión de las funciones de los distintos tipos neuronales en la función cerebral y la patología requiere la caracterización e identificación inequívoca de las neuronas. Estructuralmente, las características morfológicas definidas por ubicación somato-dendrítica determinan las entradas potenciales que recibe una neurona determinada, mientras que el patrón de arborización axonal identifica posibles dianas postsinápticos. La diversidad estructural de las neuronas ha sido apreciado desde los días de los estudios histológicos seminales de Ramón y Cajal 1. El advenimiento de las técnicas de grabación de una sola célula reveló que las neuronas estructuralmente distintas también muestran diferencias en los patrones de activación y características sinápticas. La diversidad en la estructura y la fisiología es particularmente evidente en las neuronas inhibidoras GABAérgicas 2,3. Además, se ha vuelto cada vez más evidente que structurallY neuronas similares pueden expresar diferentes marcadores neuroquímicos y muestran diferencias funcionales correspondientes 4. Del mismo modo, las neuronas con los mismos marcadores neuroquímicos pueden tener estructuras y funciones 5-10 distintas. Por lo tanto, en la práctica, el análisis de las características funcionales de las neuronas y su papel en la red implica definir tanto las identidades morfológicas y neuroquímicas. Incluso con el advenimiento de reportero líneas de ratón dirigidos marcadores neuroquímicos específicos, a menudo es necesario para determinar la morfología y la identidad de subtipo basada en inmunohistología 11.
El método estándar utilizado para caracterizar las células registradas en rodajas de cerebro agudas es llenarlos con biocitina o neurobiotin durante la grabación, fijar las secciones en paraformaldehído (PFA) siguiendo las grabaciones, y el uso de técnicas de inmunohistoquímica para revelar la morfología y la neuroquímica. Dado que el espesor de las secciones para la fisiología rebanada son típicamente 300 micraso más, y porque la mayoría de los anticuerpos no pueden penetrar todo el camino a través de esa profundidad, las rodajas deben ser re-seccionada a 60 micras o menos para permitir la inmunotinción simultánea para biocitina y marcadores neuroquímicos 12-14. Desafortunadamente, resección es laborioso; corre el riesgo de pérdida de tejido durante el corte; y puede conducir a la diferencia de la contracción del tejido, lo que complica las reconstrucciones morfológicas. Además, el conocimiento previo de la morfología podría ayudar a reducir los marcadores candidatos que pueden ser expresadas por las células. Hemos modificado los protocolos inmunohistología biocitina estándar para permitir el procesamiento en serie de secciones en primer lugar para la recuperación de la morfología y luego para la identificación de posibles marcadores neuroquímicos.
La inmunohistoquímica es el estudio de la distribución de antígenos en tejidos o células y se puede visualizar usando una enzima, marcadores fluorescentes, elementos radiactivos, o partículas coloidales de oro 15. El procedimiento involves usando anticuerpos primarios para etiquetar específicamente y amplificar uno o más antígenos específicos, seguido por el uso de anticuerpos secundarios fluorescentes dirigidos al anticuerpo primario para la visualización. Debido a la necesidad de distinguir los espectros de fluorescencia de cada anticuerpo secundario sin solapamiento, sólo un número limitado de antígenos puede ser examinado de forma simultánea. Por lo tanto, el conocimiento previo de la morfología puede ser útil en la selección de los marcadores neuroquímicos candidatos para la clasificación de células. Conceptualmente, la razón de ser de procesamiento en serie de secciones teñidas ya-se basa en la premisa de que immunolabeling para una proteína o péptido no debe interferir con la antigenicidad y la posterior inmunomarcación para un péptido estructuralmente independientes 16. Esta falta de interferencia se debe a la unión de los anticuerpos a un epítopo de proteína específica en un antígeno y por lo tanto permite la tinción simultánea de múltiples antígenos en el mismo tejido. El número de antígenos revealed por inmunotinción está limitada por la necesidad de que los espectros de no acumulación de los anticuerpos secundarios fluorescentes y por la necesidad de dirigirse a antígenos individuales con anticuerpos en diferentes especies a fin de eliminar la reactividad cruzada 17,18. Si bien este es el razonamiento detrás de etiquetado en serie en lugar de simultánea con dos anticuerpos distintos que pueden interactuar, a nuestro conocimiento, la inmunotinción para un segundo antígeno no ha sido reportado después de la finalización de inmunomarcaje para uno o más antígenos en secciones montadas. A continuación, se describe un método para la inmunotinción de serie de secciones previamente teñidos y montados. A pesar de que el detalle de este proceso para un procedimiento immunolabeling serie para la recuperación de la morfología seguido de tinción para los marcadores de proteína / péptido en secciones gruesas, los mismos procedimientos se pueden utilizar en la norma, las secciones histológicas delgadas también. Además, se describe un enfoque práctico para llenar neuronas registradas con biocitina y el proceso para desalojar elelectrodo de la célula tras la finalización de grabaciones para optimizar el llenado de la axonal y cenadores dendríticas de neuronas, tal como se presenta en nuestra reciente 6,8 trabajo.
La ventaja más importante del procedimiento descrito aquí es que la morfología de la célula registrada puede ser totalmente recuperado y fotografiado antes de intentar la resección o immunostain las rebanadas. A pesar de los problemas con la penetración de ciertos anticuerpos pueden hacer necesario rebanadas de resección para inmunotinción secundaria, los procedimientos que se detallan aquí eliminarían la necesidad de reconstruir las neuronas complejas de múltiples secciones y evitarían problemas debido a la pérdida de tejido y contracción diferencial, lo que puede comprometer la reconstrucción tras resecciones. Una ventaja añadida es que el proceso va a reducir costes, tiempo, esfuerzo y anticuerpos costosos mediante la limitación de la inmunotinción y volver a seccionar a rodajas en el que se recuperan las neuronas biocitina llenas. El aspecto más práctico es el anuncioinmunotinción condicional que puede ser realizado en las secciones teñidas meses antes de usar la técnica antes mencionada. En particular, la recuperación de la morfología reduciría considerablemente el potencial de que los datos fisiológicos de las células se descarta debido a la incapacidad para obtener una caracterización morfológica básica del tipo de célula.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos críticos dentro del Protocolo
Llenar la celda parcheado con biocitina es el paso más importante para garantizar la recuperación completa de la morfología. Para la recuperación total de la célula, es esencial para seleccionar una orientación óptima rebanada para minimizar la ruptura de los procesos durante el rebanado. Esta orientación puede variar en función del tipo de circuito y de la célula bajo examen. A continuación, es esencial para permitir un ti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer el apoyo de los NIH / NINDS R01 NS069861 y NJCBIR CBIR14IRG024 a VS.
Materials
| NaCl | Sigma | S7653 | Immunostaining |
| KCL | Fluka | 60129 | Immunostaining |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | Immunostaining |
| KH2PO4 | Sigma | 229806 | Immunostaining |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Immunostaining |
| Guinea pig anti CB1 | Sigma | Af530-1 | Immunostaining |
| Mouse anti CCK | CURE, UCLA | courtesy of G. Ohning | Immunostaining |
| Rabbit anti Parvalbumin | Swant | PV27 | Immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor conjugate | Molecular Probes | S11227 | Immunostaining |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | Immunostaining |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Immunostaining |
| Secondary Antibodies | Invitogen Molecular probes | Alexa Fluor conjugated dyes | Immunostaining |
| Labnet orbit low speed shaker | Bioexpress | S-2030-LS | Immunostaining |
| Forceps | Dumont | 11231-30 | Immunostaining |
| Slide folders | EMS | 71520 | Immunostaining |
| Vibratome VT 1200 S | Leica | 14048142066 | Electrophysiology |
| Multiclamp 700B amplifier | Molecular devices | Multiclamp 700B | Electrophysiology |
| pCLAMP 10 Software | Molecular devices | pCLAMP 10 | Electrophysiology |
| Digitizer | Molecular Devices | Digidata 1440 digitizer | Electrophysiology |
| Filter tips | Nalgene | 171-0020 | Electrophysiology |
| Sonicator | Fisher Scientific | 15-335-100 | Electrophysiology |
| Microloaders | Eppendorf | 930001007 | Electrophysiology |
| Biocytin | Sigma | B4261 | Electrophysiology |
References
- Garcia-Lopez, P., Garcia-Marin, V., Freire, M. The histological slides and drawings of cajal. Front Neuroanat. 4, 9 (2010).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
- Petilla Interneuron Nomenclature, G., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
- Armstrong, C., Soltesz, I. Basket cell dichotomy in microcircuit function. J Physiol. 590 (4), 683-694 (2012).
- Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells. PLoS One. 8 (8), e70553 (2013).
- Gupta, A., Elgammal, F. S., Proddutur, A., Shah, S., Santhakumar, V. Decrease in tonic inhibition contributes to increase in dentate semilunar granule cell excitability after brain injury. J Neurosci. 32 (7), 2523-2537 (2012).
- Fish, K. N., Hoftman, G. D., Sheikh, W., Kitchens, M., Lewis, D. A. Parvalbumin-containing chandelier and basket cell boutons have distinctive modes of maturation in monkey prefrontal cortex. J Neurosci. 33 (19), 8352-8358 (2013).
- Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate cannabinoid-sensitive interneurons undergo unique and selective strengthening of mutual synaptic inhibition in experimental epilepsy. Neurobiol Dis. 89, 23-35 (2016).
- Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate total molecular layer interneurons mediate cannabinoid-sensitive inhibition. Hippocampus. 25 (8), 884-889 (2015).
- Varga, C., et al. Functional fission of parvalbumin interneuron classes during fast network events. Elife. 3, (2014).
- Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age. Neural Circuits Revealed. , 109 (2015).
- Krook-Magnuson, E., Luu, L., Lee, S. H., Varga, C., Soltesz, I. Ivy and neurogliaform interneurons are a major target of mu-opioid receptor modulation. J Neurosci. 31 (42), 14861-14870 (2011).
- Szabadics, J., Soltesz, I. Functional specificity of mossy fiber innervation of GABAergic cells in the hippocampus. J Neurosci. 29 (13), 4239-4251 (2009).
- Iball, J., Ali, A. B. Endocannabinoid Release Modulates Electrical Coupling between CCK Cells Connected via Chemical and Electrical Synapses in CA1. Front Neural Circuits. 5, 17 (2011).
- Chen, X., Cho, D. -. B., Yang, P. -. C. Double staining immunohistochemistry. N Am J Med Sci. 2 (5), 241-245 (2010).
- Ranjan, A. K., et al. Cellular detection of multiple antigens at single cell resolution using antibodies generated from the same species. Journal of immunological. 379 (1), 42-47 (2012).
- Fuccillo, D. A., Sever, J. L. . Concepts in Viral Pathogenesis II. , 324-330 (1986).
- Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting. Acta Histochem. 107 (2), 143-148 (2005).
- Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and morphological characterization of neuronal microcircuits in acute brain slices using paired patch-clamp recordings. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (95), e52358 (2015).
- Walz, W. . Patch-clamp analysis : advanced techniques. 2nd edn. , (2007).
- Molnar, P. . Patch-clamp methods and protocols. 403, (2007).
- Martina, M., Taverna, S. . Patch-clamp methods and protocols. , (2014).
- Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons). J Vis Exp. (91), e51706 (2014).
- Jinno, S., Kosaka, T. Immunocytochemical characterization of hippocamposeptal projecting GABAergic nonprincipal neurons in the mouse brain: a retrograde labeling study. Brain research. 945 (2), 219-231 (2002).
- Yu, J., Proddutur, A., Swietek, B., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Functional Reduction in Cannabinoid-Sensitive Heterotypic Inhibition of Dentate Basket Cells in Epilepsy: Impact on Network Rhythms. Cereb Cortex. , (2015).
- Proddutur, A., Yu, J., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Seizure-induced alterations in fast-spiking basket cell GABA currents modulate frequency and coherence of gamma oscillation in network simulations. Chaos. 23 (4), 046109 (2013).
- Scharfman, H. E. Differentiation of rat dentate neurons by morphology and electrophysiology in hippocampal slices: granule cells, spiny hilar cells and aspiny ‘fast-spiking’ cells. Epilepsy Res Suppl. 7, 93-109 (1992).
- Tasker, J. G., Hoffman, N. W., Dudek, F. E. Comparison of three intracellular markers for combined electrophysiological, morphological and immunohistochemical analyses. J Neurosci Methods. 38 (2-3), 129-143 (1991).
