Magnetisk Levitation Sammen med Portable Imaging og Analyse for sygdomsdiagnostik

Summary

We present a magnetic levitation technique coupled with automated imaging and analysis in both a smartphone-compatible device and a device with embedded imaging and processing. This is applied to measure the density distribution of cells with two demonstrated biomedical applications: sickle cell disease diagnosis and separating white and red blood cells.

Abstract

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for specialized equipment and trained personnel require that many diagnostic tests be performed at remote, centralized clinical laboratories. Magnetic levitation is a simple yet powerful technique and can be applied to levitate cells, which are suspended in a paramagnetic solution and placed in a magnetic field, at a position determined by equilibrium between a magnetic force and a buoyancy force. Here, we present a versatile platform technology designed for point-of-care diagnostics which uses magnetic levitation coupled to microscopic imaging and automated analysis to determine the density distribution of a patient’s cells as a useful diagnostic indicator. We present two platforms operating on this principle: (i) a smartphone-compatible version of the technology, where the built-in smartphone camera is used to image cells in the magnetic field and a smartphone application processes the images and to measures the density distribution of the cells and (ii) a self-contained version where a camera board is used to capture images and an embedded processing unit with attached thin-film-transistor (TFT) screen measures and displays the results. Demonstrated applications include: (i) measuring the altered distribution of a cell population with a disease phenotype compared to a healthy phenotype, which is applied to sickle cell disease diagnosis, and (ii) separation of different cell types based on their characteristic densities, which is applied to separate white blood cells from red blood cells for white blood cell cytometry. These applications, as well as future extensions of the essential density-based measurements enabled by this portable, user-friendly platform technology, will significantly enhance disease diagnostic capabilities at the point of care.

Introduction

Her præsenteres en teknologisk platform og en teknik, der anvender magnetisk levitation koblet med automatiseret billeddannelse og analyse til at analysere tætheden distribution af en patients celler som en indikator for sygdom. Denne alsidige fremgangsmåde til densitet-baserede cytometrisk analyse kan i sidste ende anvendes til en række diagnostik sygdomstilstande. Men for at være forenelig med point-of-care test og brug i udviklingslandene, skal teknikken opfylde kravene til lave omkostninger, portabilitet og brugervenlighed. Enheden og forbrugsstoffer skal let opnås til en lav pris. Forberedelsen Prøven skal være enkel, bør analyse automatiseres med minimale krav til brugerinput eller fortolkning, og resultaterne skal returneres hurtigt. Endvidere skal anordningen være kompakt og bærbar at være nyttige i kliniske omgivelser samt udviklingslande. Således har vi udviklet et apparat og metode til at bruge magnetisk levitation i point-of-care-kompatibel teknologi ved kobling automatiseret billedbehandling og billedanalyse at returnere resultater vedrørende tætheden fordeling af en population af en patients celler.

Point-of-care teknologier giver en bemærkelsesværdig fordel i forhold til de nuværende kliniske procedurer laboratorieundersøgelser. Den eksisterende teknologis er for dyrt at være ejet af en kliniker eller for komplekse til at blive udført af medicinsk personale. Mange af disse procedurer kræver arbejdskraftintensive protokoller, som skal udføres af en uddannet tekniker. Af disse grunde er patientprøver såsom blod eller urin generelt indsamlet i lægens kontor derefter overført til en fjern, centraliseret laboratorium til klinisk afprøvning, der kan tage flere dage for lægen at modtage resultaterne af testen. Dette kan medføre forsinkelser eller komplikationer i løbet af behandlingen i nogle tilfælde gør denne test meget dyrt og ineffektivt (forårsager en økonomisk byrde for forsikring betalere), og yderligere gør mangediagnostik utilgængelige i ressourcesvage indstillinger og udviklingslande.

Her præsenteres en magnetisk levitation teknik kombineret med automatiseret billeddannelse og analyse i både en enhed med indbygget billedbehandling og forarbejdning (figur 1) og en indretning smartphone-kompatibel (figur 2). Disse magnetiske levitation-baserede enheder repræsenterer en bredt anvendelig platform teknologi, som har potentialet til at blive anvendt på en række forskellige medicinske diagnostiske anvendelser. De magnetiske funktioner tilgang levitation baseret på en ligevægt mellem to kræfter: en magnetisk kraft og en opdriftskraft ^{1, 2, 3.} Når en partikel er suspenderet i en paramagnetisk medium og indsat i et magnetfelt genereret af to magneter med ens poler vender mod hinanden, en magnetisk kraft virker på partiklen i retningen mod midterlinien mellem de to MAGN ets. Opdriften er forårsaget af den relative massefylde af partiklen i forhold til suspensionsmediet og er opad i tilfælde af partikler mindre tætte end mediet og nedad i tilfælde af partikler med højere densitet end det omgivende medium. Baseret på disse to kræfter, vil partiklerne når en ligevægt levitation position inden der afbalancerer disse to kræfter; denne stilling er direkte relateret til densiteten af ​​partiklen, med tungere partikler leviterende lavere i marken end mindre tætte partikler. Et billeddannende modul, enten et indbygget smartphone kamera ^{4, 5, 6} eller uafhængige optiske komponenter udstyret med en forstørrelseslinse ^{7, 8,} anvendes til at visualisere placeringen af partiklerne. Billedbehandling, enten via en smartphone-applikation ^{4, 5,}= "xref"> 6 eller en indlejret processeringsenhed ^{7, 8,} fremgangsmåder derefter det optagne billeder til at kvantificere den rumlige fordeling og dermed tætheden fordeling af befolkningen. For at analysere større prøver (såsom dem med kun et par partikler af interesse per milliliter, kan flowet integreres direkte i enheden sådanne partiklerne leviteret og analyseres som de passerer gennem den billeddannende region (figur 2).

Figur 1: Selvstændig Magnetic Levitation Platform. (A) Kompakt magnetisk levitation enhed, herunder en magnetisk fokus modul, billedbehandling komponenter (en lysdiode (LED), en optisk linse, og et kamera detektor), og en behandlingsenhed med en skærm. (B) Magnetisk feltstyrke på cross-sektion af området mellem magneterne hvor der er indsat prøven. Feltstyrken er størst ved overfladen af ​​magneterne og nærmer sig nul på midterlinien mellem dem. (C) partikler, såsom celler, inden for de magnetiske felt opleve flere kræfter: en magnetisk kraft (F _m) mod midterlinien mellem magnetisme, med størrelsesorden varierende på basis af positionen af partiklen; en tyngdekraft (F _G '), som afhænger af partikel tæthed i forhold til den for suspenderingsmedium, og en friktionskraft (F _d) modsætter partiklen bevægelse. Gengivet med tilladelse fra Yenilmez, et al. ⁸ Klik her for at se en større version af dette tal.

figure 2: Smartphone-kompatibel Flow-assisteret Magnetic Levitation Platform. (A – c) Front (a), side (b), og tilbage (c) visninger af magnetisk levitation indretning (d) Komponenterne af indretningen omfatter: 1) Magnetisk levitation modul, herunder permanente magneter, en forstørrelseslinse, og en LED og lysspreder, 2) smartphone case, 3) elektronik, herunder en microcontroller, pumpe driver, og Bluetooth-modtager, 4) mikro-pumpe holder, 5) justerbar blænde, 6) affald rør holder, 7) batteriholder, 8 ) prøve indehaver, 9) dobbelt formål stativ og låg. (E) Flow skematisk viser pumpning af prøven gennem magnetfeltet. (F) Tværsnit af den magnetiske levitation modul, der viser, hvordan partikler med forskellige densiteter vil bringe som de er pumpet gennem feltet; mindre tætte partikler, såsom Particle 1, vil ligevægt ved en højere levitation højde tHan tættere partikler, såsom Partikel 2. Gengivet med tilladelse fra Amin, et al. ¹ Klik her for at se en større version af dette tal.

De minimumskrav til brug af enhver prøve til distribution density analyse i dette system omfatter muligheden for at opnå en suspension af celler eller partikler større end ca. 5 um og mindre end ca. 250 um i størrelse (for billedbehandling og billedbehandling) og dens forenelighed med blanding i en opløsning af en paramagnetisk opløsning såsom den gadobutrol bruges her. Til diagnostik sygdomstilstande, kompatible programmer indbefatter dem, hvori (i) celler af interesse i sig selv har en ændret densitet når de bærer en sygdom sammenlignet med raske kontroller, (ii) en densitet ændring kan induceres i cellen ved tilsætning af et reagens eller nogle alternativ behandling for en kort icubation tid, eller (iii) forskellige celletyper bliver identificeret i en enkelt prøve, og i sagens natur (eller via nogle behandling) har unikke karakteristiske tætheder.

Seglcellesygdom er en genetisk sygdom forårsager en muteret form af hæmoglobin, HbS, der skal produceres i en persons røde blodlegemer (RBC), hvilket kan resultere i intermitterende vasookklusive begivenheder og kronisk hæmolytisk anæmi ^9. Det er diagnosticeret ved hjælp af enten hæmoglobin isoelektrisk fokusering, højtydende væskekromatografi (HPLC) fraktionering eller hæmoglobin elektroforese som er meget præcis, men skal udføres i et klinisk laboratorium, fordi de er uforenelige med point-of-care-indstillinger. Opløselighed og papirbaserede test for seglcelleanæmi er blevet foreslået, men generelt kræver subjektive bruger fortolkning og bekræftende test. Her bruger vi en massefylde tilgang til at identificere segl RBC, som opnår en højere densitet end RBCs fra folk uden seglcelleanæmi. Den mekanisme involverer polymerisation af den muterede form af hæmoglobin, HbS, som forårsager RBC dehydrering i seglcellesygdom RBC'er under deoxygeneret betingelser ^{10, 11, 12, 13.}

Kan også anvendes denne tæthed tilgang til at adskille celler af forskellige typer på grundlag af massefylde: hvide blodlegemer (WBCs) og RBC'er ^7. WBCs er generelt ansvarlige for at bekæmpe infektioner i kroppen. WBC cytometri kan anvendes til at kvantificere antallet af disse celler i blodet og fungerer som en nyttig diagnostisk værktøj. WBC tæller højere end normalt (generelt anses for større end 11.000 celler pr uL) kan indikere infektion, immunsystemet lidelser, eller leukæmi. WBC-tal under normalområdet (omkring 3.500 celler pr pi) kan være forårsaget af autoimmune lidelser eller conditioner, som skader knoglemarv. I modsætning til alternative teknologier, er den proces, der præsenteres her ikke stole på lyse af de røde blodlegemer eller pletter for at identificere WBCs. Denne celle-baseret test drager fordel af de unikke iboende densiteter af de to celletyper til at udføre separation, som WBC befolkningstæthed er blevet rapporteret at være lavere end den RBC befolkning som beregnet tidligere anvendelse af densitetsgradientcentrifugering ^{2, 3.}

Sammenlignet med alterative testning på fjerne steder, denne test er hurtig, med simpel prøveforberedelse (figur 3), adskillelse af celler i indretningen inden for 10 – 15 min, og automatiseret billeddannelse og analyse, der kræver mindre end 1 min. På denne måde kan enheden returnere resultater hurtigt for bedre at informere medicinske beslutninger, tillade behandling, der skal administreres straks at lindre fysisk og psykisk smerte, og mindske risikoen for komplikationer associeredeated med en forsinkelse i medicinsk behandling. Denne teknik kan udføres på stedet, enten i kliniske omgivelser på grund af simpel prøveforberedelse og automatiseret billedbehandling og analyse, der returnerer et resultat med minimal brugerinput eller fortolkning. På grund af anvendelsen af ​​en enkel fremgangsmåde ved anvendelse permanente magneter til prøveanalyse og anvendelse af enten en smartphone eller simple elektriske komponenter til billeddannelse og billedbehandling, enheden samt omkostningerne pr-test er minimale sammenlignet med nogle sofistikerede testprocedurer.

Protocol

Etisk Statement: Alle procedurer, der involverer humane blodprøver blev udført i henhold til de institutionelle bestemmelser. Alle protokoller blev revideret og godkendt af Institutional Review Board. En informeret samtykke blev givet af alle deltagere. 1. Prøve Forberedelse til seglcellesygdom Diagnose 5, 8 Forbered en 50 mM opløsning af gadobutrol i Hanks Balanced Salt Solution (HBSS). Opløs 10 mM natriumm…

Representative Results

For celledensitet fordeling analyse, som er den teknik, der anvendes til seglcellesygdom diagnose, er målet at identificere bredden af ​​fordelingen af ​​cellepopulationen. Blodlegemer patienter uden seglcellesygdom vil ligge inden for en forudsigelig bredde. Celler fra patienter med seglcellesygdom vil blive fordelt overalt i en bredere område, med en nedadgående skævhed i cellen distribution (se figur 4.) For enhver særlig anvendelse, kan en tærskel indst…

Discussion

Kritiske trin i protokollen
Kritiske faktorer i denne proces, omfatter korrekt tilpasning af magneterne. Hvis magneterne løsne eller adskilt mere end normalt i enheden, kan det påvirke resultaterne. For at kontrollere for denne fejl eller andre i processen, en densitet-kontrolleret partikel, såsom polystyren mikrokugler, kan anvendes periodisk til at kontrollere for ændringer over tid. Endvidere levitation tid er vigtigt at give cellerne til at nå ligevægt. For røde blodlegemer, 10 min er tilstrækkelig ti…

Materials

Gadavist (Bayer)	Jefferson Medical and Imaging	2068062	Gadavist contains 1M gadobutrol, a chelate of gadolinium. We purchased 2 mL vials with 15/ca.
Square glass microcapillary tubes	Vitrocom	8270	50 mm length is sufficient
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	S9000	Chemical formula: Na2S2O5
Leica Microsystems Critoseal tube sealant	Fisher Scientific	02-676-20
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	H9269 SIGMA
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	Or other reagent as recommended for the cell type used
MICROLET 2 Adjustable Lancing Device	Walgreens	246567	Any lancing device is acceptable when used according to biosafety protocols
Microlet Lancets	Walgreens	667474	Must be dispoable and not reused
Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer	Fisher Scientific	02-671-6	Or any preferred method for cell counting
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher	A1049201