Lévitation magnétique Couplé avec imagerie portable et d'analyse pour le diagnostic de la maladie

Summary

We present a magnetic levitation technique coupled with automated imaging and analysis in both a smartphone-compatible device and a device with embedded imaging and processing. This is applied to measure the density distribution of cells with two demonstrated biomedical applications: sickle cell disease diagnosis and separating white and red blood cells.

Abstract

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for specialized equipment and trained personnel require that many diagnostic tests be performed at remote, centralized clinical laboratories. Magnetic levitation is a simple yet powerful technique and can be applied to levitate cells, which are suspended in a paramagnetic solution and placed in a magnetic field, at a position determined by equilibrium between a magnetic force and a buoyancy force. Here, we present a versatile platform technology designed for point-of-care diagnostics which uses magnetic levitation coupled to microscopic imaging and automated analysis to determine the density distribution of a patient’s cells as a useful diagnostic indicator. We present two platforms operating on this principle: (i) a smartphone-compatible version of the technology, where the built-in smartphone camera is used to image cells in the magnetic field and a smartphone application processes the images and to measures the density distribution of the cells and (ii) a self-contained version where a camera board is used to capture images and an embedded processing unit with attached thin-film-transistor (TFT) screen measures and displays the results. Demonstrated applications include: (i) measuring the altered distribution of a cell population with a disease phenotype compared to a healthy phenotype, which is applied to sickle cell disease diagnosis, and (ii) separation of different cell types based on their characteristic densities, which is applied to separate white blood cells from red blood cells for white blood cell cytometry. These applications, as well as future extensions of the essential density-based measurements enabled by this portable, user-friendly platform technology, will significantly enhance disease diagnostic capabilities at the point of care.

Introduction

Ici, nous présentons une plate-forme technologique et une technique qui utilise la lévitation magnétique couplée à l'imagerie et l'analyse automatisé pour analyser la répartition de la densité des cellules d'un patient comme un indicateur de la maladie. Cette approche polyvalente pour l'analyse cytométrique basé sur la densité peut finalement être appliquée à une gamme de diagnostics de la maladie. Toutefois, afin d'être compatible avec les tests de point de soins et d'utilisation dans les pays en développement, la technique doit satisfaire aux exigences de faible coût, la portabilité et la facilité d'utilisation. Le dispositif et les consommables doivent être obtenus facilement à un faible coût. La préparation de l'échantillon doit être simple, l'analyse doit être automatisé avec des exigences minimales pour l'entrée ou l'interprétation utilisateur, et les résultats doivent être retournés rapidement. En outre, l'appareil doit être compact et portable pour être utile dans les milieux cliniques, ainsi que les pays en développement. Ainsi, nous avons développé un dispositif et un procédé pour utiliser sustentation magnétique au point-of-care compatible technollogie par couplage automatisé d'imagerie et d'analyse d'images pour retourner des résultats en ce qui concerne la distribution de densité d'une population de cellules d'un patient.

technologies de point de soins offrent un avantage notable par rapport aux procédures cliniques en cours d'essais en laboratoire. La technologie actuellement disponible est trop cher pour être détenue par un clinicien ou trop complexe pour être effectué par le personnel médical. Bon nombre de ces procédures nécessitent des protocoles de main-d'œuvre qui doivent être effectuées par un technicien qualifié. Pour ces raisons, les échantillons de patients tels que le sang ou l'urine sont généralement recueillies dans le bureau du médecin puis transféré à un laboratoire d'essai centralisé à distance pour les essais cliniques, ce qui peut prendre plusieurs jours pour le médecin de recevoir les résultats de l'essai. Cela peut entraîner des retards ou des complications au cours du traitement dans certains cas, rend ce test très coûteux et inefficace (entraînant un fardeau financier pour les contribuables d'assurance), et fait encore beaucoupdiagnostics inaccessibles dans les milieux à faibles ressources et les pays en développement.

Ici, nous présentons une technique de lévitation magnétique couplée à l' imagerie automatisée et d' analyse à la fois un dispositif d'imagerie embarqué et le traitement (Figure 1) et un dispositif de smartphone compatible (Figure 2). Ces dispositifs à base de lévitation magnétique constituent une plate-forme technologique largement applicable qui a le potentiel d'être appliquée à toute une gamme de différentes applications de diagnostic médical. Les fonctions magnétiques d'approche de sustentation basé sur un équilibre entre deux forces: une force magnétique et une force de flottabilité ^{1, 2, 3.} Lorsqu'une particule en suspension dans un milieu paramagnétique et inséré dans un champ magnétique généré par deux aimants avec des pôles analogues se faisant face, une force magnétique agit sur la particule dans la direction vers la ligne médiane entre les deux magn ets. La force de poussée est provoqué par la densité relative de la particule par rapport au milieu de suspension et vers le haut dans le cas de particules moins denses que le milieu et vers le bas dans le cas des particules plus denses que le milieu environnant. Sur la base de ces deux forces, les particules atteignent une position d'équilibre de sustentation dans le domaine qui équilibre ces deux forces; cette position est directement liée à la densité de la particule, avec les particules plus denses en lévitation dans le champ plus faible que les particules les moins denses. Un module d'imagerie, soit un appareil photo intégré smartphone ^{4, 5, 6} ou composants optiques indépendants équipés d'une lentille grossissante ^{7, 8,} sont utilisés pour visualiser les positions des particules. Traitement d'image, soit par le biais d' une application smartphone ^{4, 5,}= "référence externe"> 6 ou une unité de traitement intégrée ^{7, 8,} puis traite les images capturées pour quantifier la répartition spatiale et, par conséquent, la répartition de la densité de la population. Afin d'analyser des échantillons plus importants (tels que ceux avec seulement quelques particules d'intérêt par millilitre, le débit peut être intégré directement dans le dispositif de telles particules sont léviter et analysées lors de leur passage à travers la région d'imagerie (Figure 2).

Figure 1: Magnetic Levitation Plate – forme autonome. (A) Dispositif de lévitation magnétique comprenant un module compact focalisation magnétique, les composants d'imagerie (une diode électroluminescente (DEL), une lentille optique, et un détecteur de la caméra), et une unité de traitement avec un écran d'affichage. (B) l' intensité du champ magnétique dans le cross-section de la zone entre les aimants lorsque l'échantillon est inséré. La force du champ est la plus grande à la surface des aimants et se rapproche de zéro à la ligne médiane entre elles. (C) des particules, telles que des cellules, dans les expériences de champ magnétique de plusieurs forces: une force magnétique (F _m) vers la ligne médiane entre les composants magnétiques, avec la grandeur variant en fonction de la position de la particule; une force de gravitation (F _g) qui dépend de la densité des particules par rapport à celle du milieu de suspension, et une force d'entraînement (F _D) résistant à la requête de la particule. Reproduit avec permission, de Yenilmez, et al. ⁸ S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figueure 2: Plate-forme Levitation Smartphone compatible Flow-assistée magnétique. (A – c) Avant (a), côté (b), et à l' arrière (c) des vues de dispositif magnétique à lévitation (d) Les composants du dispositif comprennent: 1) module de sustentation magnétique, y compris des aimants permanents, une lentille grossissante, et un diffuseur de LED et de la lumière, 2) cas smartphone, 3) l'électronique, y compris un microcontrôleur, le pilote de la pompe, et le récepteur Bluetooth, 4) porte micro-pompe, 5) orifice réglable, 6) porte-tube de déchets, 7) support de batterie, 8 ) porte-échantillon, 9) support à double usage et de la couverture. (E) d' écoulement schématique, montrant le pompage de l'échantillon à travers le champ magnétique. (F) La section du module de sustentation magnétique, montrant comment les particules de différentes densités seront alignées comme ils sont pompés à travers le champ; moins des particules denses, telles que des particules 1, vont équilibrer à une meilleure sustentation hauteur than particules plus denses, comme les particules 2. Reproduit avec permission, de Amin, et al. ¹ S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Les exigences minimales pour l'utilisation d'un échantillon pour l'analyse de la distribution de densité de ce système comprennent la possibilité d'obtenir une suspension de cellules ou de particules supérieures à environ 5 um et inférieure à environ 250 um (pour l'imagerie et le traitement d'image) et sa compatibilité avec le mélange dans une solution d'une solution paramagnétique tel que le gadobutrol utilisée ici. Pour le diagnostic des maladies, des applications compatibles comprennent ceux dans lesquels: (i) des cellules d'intérêt ont intrinsèquement une densité modifiée quand ils portent une maladie par rapport aux témoins sains, (ii) un changement de densité peut être induite dans la cellule par addition d'un réactif ou d'un traitement alternatif pour un courtTemps de cubation, ou (iii) différents types de cellules sont identifiées dans un échantillon unique et par nature (ou par l' intermédiaire d' un traitement) ont des densités caractéristiques uniques.

La drépanocytose est une maladie génétique provoquant une forme mutée de l' hémoglobine, HbS, à produire des globules rouges d'une personne (hématies), ce qui peut entraîner des événements vaso-occlusifs intermittents et une anémie hémolytique chronique ^9. Il est diagnostiqué en utilisant soit l'hémoglobine isoélectrofocalisation, chromatographie liquide à haute performance (CLHP) fractionnement ou électrophorèse de l'hémoglobine qui sont très précis mais doit être effectué dans un laboratoire d'essais cliniques parce qu'ils sont incompatibles avec les paramètres de point de soins. La solubilité et les tests à base de papier pour la drépanocytose ont été proposées, mais nécessitent généralement l'interprétation subjective de l'utilisateur et des tests de confirmation. Ici, nous utilisons une approche basée sur la densité pour identifier hématies falciformes, qui atteignent une densité supérieure à RBCs de personnes sans maladie drépanocytaire. Le mécanisme implique la polymérisation de la forme mutée de l' hémoglobine, HbS, ce qui provoque la déshydratation chez RBC falciformes hématies de la maladie des cellules dans des conditions désoxygéné ^{10, 11, 12, 13.}

Cette approche basée sur la densité peut également être appliquée pour séparer les cellules de différents types sur la base de la densité: globules blancs (WBC) et hématies ^7. WBCs sont généralement responsables de la lutte contre les infections dans le corps. WBC cytométrie peut être utilisée pour quantifier le nombre de ces cellules dans le sang et sert d'outil de diagnostic utile. WBC compte supérieur à la normale (généralement considérée comme supérieure à 11.000 cellules par ul) peuvent indiquer une infection, troubles du système immunitaire, ou la leucémie. WBC compte dessous de la normale (environ 3500 cellules par ul) peuvent être causés par des maladies auto-immunes ou conditions qui endommagent la moelle osseuse. Contrairement aux technologies alternatives, le processus présenté ici ne repose pas sur la lyse des globules rouges ou des taches afin d'identifier WBCs. Ce test à base de cellules tire profit des densités intrinsèques particulières des deux types de cellules pour effectuer la séparation, car la densité de population de WBC a été rapportée comme étant inférieure à celle de la population de RBC , tel que calculé précédemment en utilisant un gradient de densité de centrifugation ^{2, 3.}

Par rapport aux essais altérant des sites distants, ce test est rapide, simple , la préparation des échantillons (figure 3), la séparation des cellules dans le dispositif dans les 10 – 15 min, et l' imagerie et l' analyse automatisée qui exige moins de 1 min. De cette façon, le dispositif peut revenir rapidement des résultats pour mieux informer les décisions médicales, permettre un traitement à administrer immédiatement pour soulager la douleur physique et psychologique, et de réduire le risque de complications associATED avec un retard dans les soins médicaux. Cette technique peut être effectuée sur place, soit dans les milieux cliniques en raison de préparation simple de l'échantillon et de l'imagerie automatisée et l'analyse qui renvoie un résultat avec l'entrée minimale de l'utilisateur ou de l'interprétation. En raison de l'utilisation d'une approche simple en utilisant des aimants permanents pour l'analyse de l'échantillon et l'utilisation soit d'un smartphone ou des composants électriques simples pour l'imagerie et de traitement d'image, le dispositif ainsi que les coûts par test sont minimes par rapport à certaines procédures de tests sophistiqués.

Protocol

Déclaration éthique: Toutes les procédures impliquant des échantillons de sang humain ont été effectués selon les règles institutionnelles. Tous les protocoles ont été examinés et approuvés par le comité d'examen institutionnel. Un consentement éclairé a été donné par tous les participants. Préparation 1. Exemple de drépanocytose Diagnostic 5, 8 Préparer une solution à 50 mM de gadobutrol dans une…

Representative Results

Pour l'analyse de la répartition de la densité cellulaire, ce qui est la technique utilisée pour le diagnostic des maladies de faucille cellulaire, dont le but est d'identifier la largeur de la distribution de la population cellulaire. Les cellules sanguines des patients sans maladie drépanocytaire seront confinés à l'intérieur d'une largeur prévisible. Les cellules provenant de patients atteints de drépanocytose seront distribués dans une région plus large, av…

Discussion

Étapes critiques dans le Protocole
Les facteurs critiques dans ce processus comprennent le bon alignement des aimants. Si les aimants deviennent délogée ou séparés plus que la normale dans le dispositif, cela peut affecter les résultats. Pour contrôler ce défaut ou d'autres dans le processus, une particule de densité contrôlée, tels que des microsphères de polystyrène, peut être utilisé périodiquement pour contrôler les changements au fil du temps. En outre, le temps de lévitation est import…

Materials

Gadavist (Bayer)	Jefferson Medical and Imaging	2068062	Gadavist contains 1M gadobutrol, a chelate of gadolinium. We purchased 2 mL vials with 15/ca.
Square glass microcapillary tubes	Vitrocom	8270	50 mm length is sufficient
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	S9000	Chemical formula: Na2S2O5
Leica Microsystems Critoseal tube sealant	Fisher Scientific	02-676-20
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	H9269 SIGMA
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	Or other reagent as recommended for the cell type used
MICROLET 2 Adjustable Lancing Device	Walgreens	246567	Any lancing device is acceptable when used according to biosafety protocols
Microlet Lancets	Walgreens	667474	Must be dispoable and not reused
Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer	Fisher Scientific	02-671-6	Or any preferred method for cell counting
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher	A1049201