Levitación magnética Junto con Imaging portátil y Análisis para el diagnóstico de enfermedades

Summary

We present a magnetic levitation technique coupled with automated imaging and analysis in both a smartphone-compatible device and a device with embedded imaging and processing. This is applied to measure the density distribution of cells with two demonstrated biomedical applications: sickle cell disease diagnosis and separating white and red blood cells.

Abstract

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for specialized equipment and trained personnel require that many diagnostic tests be performed at remote, centralized clinical laboratories. Magnetic levitation is a simple yet powerful technique and can be applied to levitate cells, which are suspended in a paramagnetic solution and placed in a magnetic field, at a position determined by equilibrium between a magnetic force and a buoyancy force. Here, we present a versatile platform technology designed for point-of-care diagnostics which uses magnetic levitation coupled to microscopic imaging and automated analysis to determine the density distribution of a patient’s cells as a useful diagnostic indicator. We present two platforms operating on this principle: (i) a smartphone-compatible version of the technology, where the built-in smartphone camera is used to image cells in the magnetic field and a smartphone application processes the images and to measures the density distribution of the cells and (ii) a self-contained version where a camera board is used to capture images and an embedded processing unit with attached thin-film-transistor (TFT) screen measures and displays the results. Demonstrated applications include: (i) measuring the altered distribution of a cell population with a disease phenotype compared to a healthy phenotype, which is applied to sickle cell disease diagnosis, and (ii) separation of different cell types based on their characteristic densities, which is applied to separate white blood cells from red blood cells for white blood cell cytometry. These applications, as well as future extensions of the essential density-based measurements enabled by this portable, user-friendly platform technology, will significantly enhance disease diagnostic capabilities at the point of care.

Introduction

A continuación, presentamos una plataforma tecnológica y una técnica que utiliza la levitación magnética, junto con las imágenes y el análisis automatizado para analizar la distribución de la densidad de las células de un paciente como un indicador de la enfermedad. Este enfoque versátil para el análisis de citometría basada en la densidad en última instancia, se puede aplicar a una amplia gama de diagnóstico de enfermedades. Sin embargo, con el fin de ser compatible con las pruebas de punto de uso y cuidado en los países en desarrollo, la técnica debe satisfacer los requisitos de bajo coste, portabilidad y facilidad de uso. El dispositivo y los consumibles deben ser obtenidos fácilmente a un bajo costo. La preparación de la muestra debe ser simple, el análisis debe ser automatizado con los requisitos mínimos para la entrada del usuario o la interpretación, y los resultados deben ser devueltos rápidamente. Además, el dispositivo debe ser compacto y portátil para ser útil en la práctica clínica, así como los países en desarrollo. Por lo tanto, hemos desarrollado un dispositivo y un método para usar la levitación magnética en el punto de atención-compatibles Technolgía por análisis de imágenes y la imagen de acoplamiento automático para volver resultados con respecto a la distribución de la densidad de una población de células de un paciente.

tecnologías de punto de atención ofrecen una notable ventaja sobre los procedimientos de pruebas de laboratorio clínicos actuales. La tecnología disponible en la actualidad es demasiado caro para ser poseído por un médico o demasiado compleja para ser llevado a cabo por el personal médico. Muchos de estos procedimientos requieren mucha mano de obra protocolos que deben ser llevadas a cabo por un técnico capacitado. Por estas razones, las muestras de pacientes, tales como sangre u orina generalmente se recogen en la oficina del médico luego fue trasladado a un laboratorio remoto, centralizado prueba para los ensayos clínicos, que puede tardar varios días para que el médico para recibir los resultados de la prueba. Esto puede causar retrasos o complicaciones en el curso del tratamiento, en algunos casos, hace que esta prueba muy costoso e ineficiente (que causa una carga financiera para los pagadores de seguros), y además hace muchosdiagnóstico de difícil acceso en entornos de bajos recursos y los países en desarrollo.

A continuación, presentamos una técnica de levitación magnética, junto con las imágenes y el análisis automatizado tanto en un dispositivo con imágenes embebido y procesamiento (Figura 1) y un dispositivo compatible con teléfonos inteligentes (Figura 2). Estos dispositivos basados ​​en levitación magnética representan una tecnología de plataforma de aplicación general que tiene el potencial de ser aplicado a una variedad de diferentes aplicaciones de diagnóstico médico. Los magnéticos funciones de aproximación de levitación en base a un equilibrio entre dos fuerzas: una fuerza magnética y una fuerza de flotación ^{1, 2, 3.} Cuando una partícula se suspende en un medio paramagnético y se inserta en un campo magnético generado por dos imanes con polos iguales frente a la otra, un magnéticos fuerza actúa sobre la partícula en la dirección hacia la línea central entre los dos magn ets. La fuerza de flotación es causada por la densidad relativa de la partícula en comparación con el medio de suspensión y es hacia arriba en el caso de las partículas menos densas que el medio y la baja en el caso de partículas más densas que el medio circundante. Sobre la base de estas dos fuerzas, las partículas lleguen a una posición de equilibrio levitación en el campo que equilibre estas dos fuerzas; esta posición está directamente relacionada con la densidad de la partícula, con partículas más densas levitando menor en el campo que las partículas menos densas. Un módulo de imagen, ya sea una cámara incorporada teléfono inteligente ^{4, 5, 6} o componentes ópticos independientes equipadas con una lente de aumento ^{7, 8,} se utiliza para visualizar las posiciones de las partículas. El procesamiento de imágenes, ya sea a través de una aplicación para teléfonos inteligentes ^{4, 5,}= "xref"> 6 o una unidad de procesamiento incrustado ^{7, 8,} a continuación, procesa las imágenes capturadas para cuantificar la distribución espacial y, por lo tanto, la distribución de la densidad de la población. Con el fin de analizar muestras más grandes (tales como aquellos con sólo unas pocas partículas de interés por mililitro, el flujo puede ser integrado directamente en el dispositivo, las partículas se levitan y se analizó a medida que pasan a través de la región de formación de imágenes (Figura 2).

Figura 1: Plataforma de levitación magnética autónomo. (A) Dispositivo de levitación magnética compacta que incluye un módulo magnético de enfoque, componentes de imagen (un diodo (LED emisores de luz), una lente óptica, y un detector de la cámara), y una unidad de procesamiento con una pantalla de visualización. (B) Intensidad de campo magnético en el cross-sección de la zona entre los imanes cuando se inserte la muestra. La intensidad del campo es mayor en la superficie de los imanes y se aproxima a cero en la línea central entre ellos. (C) Las partículas, tales como las células, dentro de la experiencia de campo magnético varias fuerzas: una fuerza magnética (F _m) hacia la línea central entre el magnetismo, con magnitud basándose su variación en la posición de la partícula; una fuerza gravitacional (F _g ') que depende de la densidad de las partículas con relación a la del medio de suspensión, y una fuerza de arrastre (F _d) resistiendo el movimiento de las partículas. Reproducido, con autorización, de Yenilmez, et al. ⁸ Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

HigoUre 2: con capacidad para un teléfono inteligente asistida por flujo Plataforma de levitación magnética. (A – c) Frontal (a), lateral (b), y la parte posterior (c) vistas del dispositivo de levitación magnética (d) Los componentes del dispositivo son: 1) módulo de levitación magnética, incluyendo los imanes permanentes, una lente de aumento, y un difusor LED y la luz, 2) de casos de teléfonos inteligentes, 3) la electrónica, incluyendo un microcontrolador, controlador de la bomba, y el receptor Bluetooth, 4) soporte de micro-bomba, 5) de orificio ajustable, 6) soporte del tubo de residuos, 7) soporte de la batería, 8 ) soporte de la muestra, 9) soporte de doble propósito y la cubierta. (E) de flujo esquemático, que muestra de bombeo de la muestra a través del campo magnético. (F) de la sección transversal del módulo de levitación magnética, que muestra cómo las partículas de diferentes densidades se alinearán a medida que se bombea a través del campo; menos densas partículas, tales como partículas 1, se equilibrarán a una mayor altura de levitación tHan partículas más densas, como las partículas 2. Reproducido, con autorización, de Amin, et al. ¹ Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los requisitos mínimos para el uso de cualquier muestra para el análisis de distribución de la densidad en este sistema incluyen la capacidad de obtener una suspensión de células o partículas mayores de aproximadamente 5 micras y menos de aproximadamente 250 micras de tamaño (para formación de imágenes y procesamiento de imágenes) y su compatibilidad con la mezcla en una solución de una solución paramagnético tal como el gadobutrol utilizado aquí. Para el diagnóstico de enfermedades, aplicaciones compatibles incluyen aquellos en los que (i) las células de interés inherentemente tiene una densidad alterada cuando llevan una enfermedad en comparación con los controles sanos, (ii) un cambio de densidad puede ser inducida en la célula mediante la adición de un reactivo o algún tratamiento alternativo para un cortocircuito entiempo de incubación, o (iii) diferentes tipos de células están siendo identificados en una sola muestra y inherentemente (o a través de algún tratamiento) tienen densidades características únicas.

Enfermedad de células falciformes es un trastorno genético que causa una forma mutada de la hemoglobina, HbS, a ser producido en las células rojas de la sangre de una persona (GR), que puede resultar en eventos vaso-oclusivos intermitentes y anemia hemolítica crónica ^9. Se diagnostica utilizando la hemoglobina isoelectroenfoque, cromatografía líquida de alta resolución electroforesis (HPLC) fraccionamiento, o hemoglobina que son muy precisos, pero debe ser realizado en un laboratorio de análisis clínicos, ya que son incompatibles con los ajustes de punto de cuidado. Solubilidad y ensayos basados ​​en papel para la enfermedad de células falciformes se han propuesto, pero por lo general requieren de una interpretación subjetiva del usuario y pruebas de confirmación. Aquí, nosotros usamos un enfoque basado en la densidad de identificar los hematíes falciformes, que alcanzan una densidad mayor que RBCs de personas que no tienen la enfermedad de células falciformes. El mecanismo implica la polimerización de la forma mutada de la hemoglobina, HbS, que causa RBC deshidratación en los glóbulos rojos de drepanocitosis en condiciones desoxigenadas ^{10, 11, 12, 13.}

Este enfoque basado en la densidad también se puede aplicar para separar las células de diferentes tipos sobre la base de la densidad: Las células blancas de la sangre (WBC) y glóbulos rojos ^7. Los glóbulos blancos son generalmente responsables de la lucha contra las infecciones en el cuerpo. WBC citometría se puede usar para cuantificar el número de estas células en la sangre y sirve como una herramienta de diagnóstico útil. Los recuentos de leucocitos superior a la normal (generalmente se considera superior a 11.000 células por microlitro) puede indicar infección, trastornos del sistema inmunológico, o leucemia. Los recuentos de leucocitos por debajo del rango normal (alrededor de 3.500 células por microlitro) pueden ser causados ​​por trastornos autoinmunes o Conditiones que hueso daños ósea. A diferencia de las tecnologías alternativas, el proceso que aquí se presenta no se basa en la lisis de los glóbulos rojos o las manchas con el fin de identificar los glóbulos blancos. Esta prueba basado en células se aprovecha de las densidades inherentes únicas de los dos tipos de células para llevar a cabo la separación, como la densidad de población WBC ha informado a ser menor que la de la población RBC calculado previamente utilizando centrifugación en gradiente de densidad ^{2, 3.}

En comparación con las pruebas de alterante en lugares remotos, esta prueba es rápida, con la preparación de muestras sencillo (Figura 3), la separación de células en el dispositivo dentro de 10 a 15 min, y de formación de imágenes y el análisis automatizado que requiere menos de 1 min. De esta manera, el dispositivo puede devolver resultados con rapidez para informar mejor las decisiones médicas, permiten que el tratamiento se administre inmediatamente para aliviar el dolor físico y psicológico, y reducir el riesgo de complicaciones associated con un retraso en la atención médica. Esta técnica se puede realizar en el sitio, ya sea en el ámbito clínico debido a la preparación sencilla de la muestra y de formación de imágenes automatizado y análisis que devuelve un resultado con intervención mínima del usuario o interpretación. Debido a la utilización de un enfoque sencillo el uso de imanes permanentes para el análisis de muestras y el uso de ya sea un teléfono inteligente o componentes eléctricos simples para formación de imágenes y procesamiento de imágenes, el dispositivo, así como los costes por la prueba son mínimos en comparación con algunos procedimientos de prueba sofisticados.

Protocol

Declaración de ética: Todos los procedimientos que implican muestras de sangre humana se llevaron a cabo de acuerdo con los reglamentos institucionales. Todos los protocolos fueron revisados ​​y aprobados por la Junta de Revisión Institucional. El consentimiento informado se da por todos los participantes. 1. Preparación de muestras para la enfermedad de células falciformes Diagnóstico 5, 8 Preparar una solución…

Representative Results

Para el análisis de distribución de la densidad celular, que es la técnica utilizada para el diagnóstico de la enfermedad de células falciformes, el objetivo es identificar la anchura de la distribución de la población celular. Las células sanguíneas de los pacientes sin la enfermedad de células falciformes estarán confinadas dentro de una anchura predecible. Las células de pacientes con enfermedad de células falciformes se distribuirán a lo largo de una región más amplia…

Discussion

Los pasos críticos dentro del Protocolo
Los factores críticos en este proceso incluyen la alineación correcta de los imanes. Si los imanes se desplacen o se separan más de lo normal dentro del dispositivo, esto puede afectar a los resultados. Para el control de esta falla o otros en el proceso, una partícula densidad controlada, tales como microesferas de poliestireno, puede ser utilizado periódicamente para controlar los cambios en el tiempo. Además, el tiempo de levitación es importante para permitir qu…

Materials

Gadavist (Bayer)	Jefferson Medical and Imaging	2068062	Gadavist contains 1M gadobutrol, a chelate of gadolinium. We purchased 2 mL vials with 15/ca.
Square glass microcapillary tubes	Vitrocom	8270	50 mm length is sufficient
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	S9000	Chemical formula: Na2S2O5
Leica Microsystems Critoseal tube sealant	Fisher Scientific	02-676-20
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	H9269 SIGMA
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	Or other reagent as recommended for the cell type used
MICROLET 2 Adjustable Lancing Device	Walgreens	246567	Any lancing device is acceptable when used according to biosafety protocols
Microlet Lancets	Walgreens	667474	Must be dispoable and not reused
Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer	Fisher Scientific	02-671-6	Or any preferred method for cell counting
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher	A1049201