ריחוף מגנטי יחד עם הדמיה ניידת וניתוח עבור אבחון מחלות

Summary

We present a magnetic levitation technique coupled with automated imaging and analysis in both a smartphone-compatible device and a device with embedded imaging and processing. This is applied to measure the density distribution of cells with two demonstrated biomedical applications: sickle cell disease diagnosis and separating white and red blood cells.

Abstract

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for specialized equipment and trained personnel require that many diagnostic tests be performed at remote, centralized clinical laboratories. Magnetic levitation is a simple yet powerful technique and can be applied to levitate cells, which are suspended in a paramagnetic solution and placed in a magnetic field, at a position determined by equilibrium between a magnetic force and a buoyancy force. Here, we present a versatile platform technology designed for point-of-care diagnostics which uses magnetic levitation coupled to microscopic imaging and automated analysis to determine the density distribution of a patient’s cells as a useful diagnostic indicator. We present two platforms operating on this principle: (i) a smartphone-compatible version of the technology, where the built-in smartphone camera is used to image cells in the magnetic field and a smartphone application processes the images and to measures the density distribution of the cells and (ii) a self-contained version where a camera board is used to capture images and an embedded processing unit with attached thin-film-transistor (TFT) screen measures and displays the results. Demonstrated applications include: (i) measuring the altered distribution of a cell population with a disease phenotype compared to a healthy phenotype, which is applied to sickle cell disease diagnosis, and (ii) separation of different cell types based on their characteristic densities, which is applied to separate white blood cells from red blood cells for white blood cell cytometry. These applications, as well as future extensions of the essential density-based measurements enabled by this portable, user-friendly platform technology, will significantly enhance disease diagnostic capabilities at the point of care.

Introduction

כאן, אנו מציגים פלטפורמה טכנולוגית ו טכניקה המשתמשת ריחוף מגנטי יחד עם הדמיה אוטומטית וניתוח לנתח את התפלגות הצפיפות של התאים של חולה כאינדיקטור המחלה. גישה תכליתית זו לניתוח cytometric מבוסס צפיפות ניתן ליישם בסופו של דבר מגוון של אבחון מחלה. עם זאת, כדי להיות תואם עם בדיקות צבע של טיפול ולהשתמש במדינות מתפתחות, הטכניקה חייבת לספק את הדרישות עבור עלות נמוכה, ניידות, ואת השימושיות. המכשיר והחומרים המתכלים חייב להשיג בקלות ובעלות נמוכה. הכנת הדגימה חייבת להיות פשוט, ניתוח צריך להיות אוטומטי עם דרישות מינימאליות עבור קלט משתמש או פרשנות, ותוצאות יש להחזיר במהירות. יתר על כן, המכשיר חייב להיות קומפקטי ונייד להיות שימושי במסגרות קליניות וכן במדינות מתפתחות. לכן, פתחנו מכשיר ושיטה להשתמש ריחוף מגנטי טכנולוגית Point-of-care-תואמתogy ידי ניתוח הדמיה התמונה אוטומטית צימוד להחזיר תוצאות בדבר חלוקת צפיפות אוכלוסייה של תאים של החולה.

Point-of-care טכנולוגיות מציעות יתרון בולט מעל הליכי בדיקות מעבדה קליניים נוכחיים. הטכנולוגיה הזמינה כרגע הוא יקר מכדי להיות בבעלות מטפל או מורכבת מדי כדי להתבצע על ידי צוות רפואי. רבים מהליכים אלה דורשים פרוטוקולים עתירי עבודה שחייבת להתבצע על ידי טכנאי מיומן. מסיבות אלה, דגימות המטופל, כגון דם או שתן נאספים בדרך כלל במשרדו של הרופא, מועברים למעבדה לבדיקות מרחוק, מרכזי עבור ניסויים קליניים, אשר עשוי להימשך מספר ימים הרופא לקבל את תוצאות הבדיקה. זה יכול לגרום לעיכובים או סיבוכים במהלך טיפול ובמקרים מסוימים, עושה בדיקה זו מאוד יקרה ולא יעילה (שביקורים אלה יטילו עול כספי על משלמי ביטוח), ובהמשך גורם לנו לתחושהאבחון נגיש במסגרות דל במשאבים ומדינות מתפתחות.

כאן, אנו מציגים טכניקת ריחוף מגנטית יחד עם הדמיה אוטומטית וניתוח בשני מכשיר עם הדמיה מוטבעת ועיבוד (איור 1) למכשיר תואם לסמארטפון (איור 2). התקני ריחוף מבוסס המגנטיים אלה מייצגים פלטפורמת טכנולוגית חלים רחב אשר יש לו את הפוטנציאל להיות מיושמת על מגוון רחב של יישומים אבחוניים רפואיים שונים. תפקידי גישת הריחוף המגנטיים המבוססים על שיווי משקל בין שני כוחות: כוח מגנטי וכוח ציפת ^{1, 2, 3.} כאשר חלקיק מושעה במדיום פאראמגנטיים ונוסף שדה מגנטי שנוצר על ידי שני מגנטים בעלי קוטביות כמו זה מול זה, מעשי כוח מגנטיים על החלקיק בכיוון לעבר האמצע בין שני magn ETS. כוח הציפה נגרם על ידי הצפיפות היחסית של החלקיקים לעומת המדיום השעיית הוא כלפי מעלה במקרה של חלקיקים פחות צפופים מאשר המדיום וכלפי מטה במקרה של חלקיקים צפופים יותר סביב המדיום. בהתבסס על שני כוחות אלה, חלקיקים יגיעו למצב ריחוף שיווי משקל בתחום שמאזן שני כוחות אלה; עמדה זו קשורה באופן ישיר לצפיפות של החלקיק, עם חלקיקים צפופים מרחפים השדה נמוך מ חלקיקים צפופים פחות. מודול הדמיה, או מובנה המצלמה חכמה ^{4, 5, 6} או רכיבים אופטיים עצמאיים מצויד בעדשת מגדלת ^{7, 8,} משמש כדי להמחיש את עמדותיהם של החלקיקים. עיבוד תמונה, בין אם באמצעות יישום חכם ^{4, 5,}= "Xref"> 6 או יחידת עיבוד מוטבע ^{7, 8,} לאחר מכן מעבדת את התמונות שנתפסו לכמת את הפריסה המרחבית, ולכן חלוקת צפיפות האוכלוסייה. על מנת לנתח דגימות גדולות (כגון אלה עם רק כמה חלקיקים של עניין למיליליטר, זרימה יכולה להיות משולבת ישירות לתוך מכשיר החלקיקים כאלה לרחף ונותחה כשהם עוברים דרך אזור ההדמיה (איור 2).

איור 1: פלטפורמת ריחוף מגנטי המכיל את כל נדרש. (א) מכשיר ריחוף מגנטי קומפקטי כולל מודול התמקדות מגנטי, רכיבי הדמיה (דיודה פולטת אור (LED), עדשה אופטית, וגלאי המצלמה), ויחידת עיבוד עם מסך תצוגה. (ב) עוצמת השדה המגנטי של הקרוSS-קטע השטח שבין המגנטים שבו המדגם מוכנס. עוצמת השדה היא הגדולה ביותר על פני השטח של מגנטים שואף לאפס על האמצע ביניהם. (ג) חלקיקים, כגון תאים, בתוך הכוחות כמה ניסיון שדה המגנטי: כוח מגנטי _(מ F) לכיוון האמצע בין המגנטיות, עם גודל משתנים על פי המיקום של החלקיק; כוח כבידה _(G F ') אשר תלוי צפיפות החלקיקים ביחס לזה של המדיום מתלים, וכן כוח הגרר _(ד F) להתנגד תנועה החלקיקים. לשכפל, ברשות, מן Yenilmez, et al. ⁸ אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

תאנהיור 2: Smartphone תואם פלטפורמת ריחוף מגנטית בסיוע זרימה. (א – ג) קדמי (א), בצד (ב), ובחזרה (ג) נופים של מכשיר ריחוף מגנטי (ד) רכיבים של המכשיר כוללות: 1) מודול ריחוף מגנטי, כולל מגנטים קבועים, עדשה מגדלת, מפזר LED ואור, 2) במקרה החכם, 3) אלקטרוניקה, כולל מיקרו-בקר, הנהג המשאבה, מקלט Bluetooth, 4) בעל מיקרו-משאבה, 5) פתח מתכווננת, 6) בעל צינור פסולת, 7) מחזיק הסוללה, 8 בעל מדגם), 9) עמד דו-שימושי ומכסים. (ה) זרימה סכמטי, מראה שאיבה של המדגם דרך השדה המגנטי. (ו) חתך של מודול הריחוף המגנטי, מראה כיצד חלקיקים של צפיפויות שונות יישרו כפי שהם נשאבים דרך השדה; פחות חלקיקים צפופים, כגון חלקיקי 1, יהיו לאזן בכל t גובה ריחוף גבוההחלקיקים צפופים האן, כגון חלקיקים 2. לשכפל, ברשות, מן אמין, et al. ¹ אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

דרישות המינימום לשימוש של כל דגימת לצורך ביצוע אנליזת הפצת צפיפות במערכת זו כוללות את היכולת לקבל השעיה של תאים או חלקיקים גדולים מ כ 5 מיקרומטר ופחות מ כ 250 מיקרומטר בגודל (הדמיה ועיבוד תמונה) ובמידה שבה היא מתיישבת עם ערבוב בתמיסה של פתרון פאראמגנטיים כגון gadobutrol משמש כאן. לאבחון מחלה, יישומים תואמים כוללים את אלה שבהם (i) תאים של עניין יש מיסודו צפיפות שונה כאשר הם נושאי מחלה בהשוואה לקבוצת ביקורת בריאה, (ii) שינוי צפיפות יכול להיגרם בתא על ידי תוספת של מגיב או כמה טיפול אלטרנטיבי עבור קצרזמן cubation, או (iii) תאים מסוגים שונים מזוהים יחיד מדגם ו מטבעם (או באמצעות איזה טיפול) יש צפיפות מאפיין ייחודית.

אנמיה חרמשית היא מחלה גנטית גורמת צורת מוטציה של המוגלובין, HBS, כדי להיות מיוצר תאי הדם האדום של אדם (RBCs), אשר יכול לגרום לאירועים לסירוגין vaso-occlusive ו ^-9 אנמיה המוליטית כרונית. זה מאובחן או באמצעות התמקדות isoelectric המוגלובין, כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים (HPLC) חלוקה, או אלקטרופורזה המוגלובין שהן מאוד מדויקים אבל חייבות להתבצע במעבדת ניסויים קלינית משום שהם אינם עולים בקנה אחד עם הגדרות צבע של טיפול. מסיסויות ובדיקות מבוססות נייר עבור מחלה חרמשית הוצעו, אך בדרך כלל דורשות פרשנות המשתמשים סובייקטיבית ובדיקה מאשר. כאן, אנו משתמשים גישה מבוססת-צפיפות לזהות RBCs מגל, אשר להשיג צפיפות גבוהה יותר מאשר RBCs מאנשים ללא אנמיה חרמשית. המנגנון כרוך פילמור של טופס מוטציה של המוגלובין, HBS, הגורמת להתייבשות RBC ב RBCs מחלה חרמשית בתנאים deoxygenated ^{10, 11, 12, 13.}

צפיפות זו מבוססת גישה יכולה להיות מיושמת גם על מנת להפריד בין תאים מסוגים שונים על בסיס צפיפות: תאי דם לבנים (WBCs) ו RBCs ^7. WBCs הוא בדרך כלל אחראי למלחמה בזיהומים בגוף. ניתן להשתמש cytometry WBC לכמת את מספר התאים הללו בדם ומשמש ככלי אבחון שימושיים. WBC ספירת גבוה מהרגיל (נחשב בדרך כלל יותר מ -11,000 תאים לכל μL) עשוי להצביע על זיהום, הפרעות במערכת החיסונית, או לוקמיה. WBC ספירה מתחת לטווח הנורמלי (כ -3,500 תאים לכל μL) עלולים להיגרם על ידי הפרעות או קונדיט אוטואימוניותמיונים מח עצם נזק. בניגוד טכנולוגיות חלופיות, התהליך המוצג כאן אינו מסתמך על תמוגה של RBCs או כתמים על מנת לזהות WBCs. מבחן מבוסס תא זו מנצל את צפיפות הטמון הייחודית של שני סוגי התאים לבצע הפרדה, כמו צפיפות אוכלוסיית WBC דווחה להיות נמוך מזה של אוכלוסיית RBC כפי שהיא מחושבת על שיפוע צפיפות בעבר צנטריפוגה ^{2, 3.}

לעומת בדיקות alterative במקומות מרוחקים, המבחן הזה הוא מהיר, עם הכנת מדגם פשוט (איור 3), הפרדת תאים בהתקן תוך 10 – 15 דקות, ו הדמיה אוטומטית ניתוח אשר דורשת פחות מ 1 דקות. בדרך זו, המכשיר יכול להחזיר תוצאות מהר להודיע ​​החלטות רפואיות טוב יותר, לאפשר טיפול להינתן מייד כדי להקל על כאב פיזי ונפשי, וכן להפחית את הסיכון של סיבוכי associated עם עיכוב טיפול רפואי. טכניקה זו יכולה להתבצע באתר או במסגרות קליניות עקב הכנת מדגם פשוט הדמיה אוטומטית וניתוח אשר מחזירה תוצאה עם קלט או פרשנות משתמש מינימאלי. בגלל השימוש בגישה פשוטה באמצעות מגנטים קבועים לניתוח מדגם והשימוש או סמארטפון או רכיבים חשמליים פשוטים הדמיה ועיבוד תמונה, המכשיר כמו גם את העלויות לכל מבחן הם מינימאליים לעומת כמה נהלי בדיקות מתוחכמים.

Protocol

הצהרה אתית: כל הנהלים הקשורים דגימות דם אדם בוצעו על פי ההתקנות המוסדיות. כל הפרוטוקולים היו נבדקו ואושרו על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי. הסכמה מודעת ניתנה על ידי כל המשתתפים. 1. הכנת דוגמאות עבור 5 אבחון מחלה חרמשי?…

Representative Results

לקבלת ניתוח התפלגות צפיפות התאים, המהווה את טכניקה המשמשת לאבחון מחלת אנמיה חרמשית, המטרה היא לזהות את רוחב של חלוקת האוכלוסייה התא. תאי דם מחולים ללא אנמיה חרמשית יהיו כלוא בתוך רוחב לחיזוי. תאי מחולים עם מחלה חרמשית יופצו ברחבי אזור רחב יותר, עם הט?…

Discussion

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול
גורמים קריטיים בתהליך הזה כוללים את היישור הנכון של המגנטים. אם המגנטים להיות שלא במקומם או מופרדים יותר מרגיל בתוך המכשיר, זה יכול להשפיע על התוצאות. כדי לשלוט על פגם זה או אחר בתהליך, חלקיק שבשליטת צפיפות, כגון microspheres קלקר, שניתן להש?…

Materials

Gadavist (Bayer)	Jefferson Medical and Imaging	2068062	Gadavist contains 1M gadobutrol, a chelate of gadolinium. We purchased 2 mL vials with 15/ca.
Square glass microcapillary tubes	Vitrocom	8270	50 mm length is sufficient
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	S9000	Chemical formula: Na2S2O5
Leica Microsystems Critoseal tube sealant	Fisher Scientific	02-676-20
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	H9269 SIGMA
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	Or other reagent as recommended for the cell type used
MICROLET 2 Adjustable Lancing Device	Walgreens	246567	Any lancing device is acceptable when used according to biosafety protocols
Microlet Lancets	Walgreens	667474	Must be dispoable and not reused
Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer	Fisher Scientific	02-671-6	Or any preferred method for cell counting
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher	A1049201