Magnetic Levitation Gekoppelt mit tragbaren Imaging und Analyse für Krankheitsdiagnostik

Summary

We present a magnetic levitation technique coupled with automated imaging and analysis in both a smartphone-compatible device and a device with embedded imaging and processing. This is applied to measure the density distribution of cells with two demonstrated biomedical applications: sickle cell disease diagnosis and separating white and red blood cells.

Abstract

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for specialized equipment and trained personnel require that many diagnostic tests be performed at remote, centralized clinical laboratories. Magnetic levitation is a simple yet powerful technique and can be applied to levitate cells, which are suspended in a paramagnetic solution and placed in a magnetic field, at a position determined by equilibrium between a magnetic force and a buoyancy force. Here, we present a versatile platform technology designed for point-of-care diagnostics which uses magnetic levitation coupled to microscopic imaging and automated analysis to determine the density distribution of a patient’s cells as a useful diagnostic indicator. We present two platforms operating on this principle: (i) a smartphone-compatible version of the technology, where the built-in smartphone camera is used to image cells in the magnetic field and a smartphone application processes the images and to measures the density distribution of the cells and (ii) a self-contained version where a camera board is used to capture images and an embedded processing unit with attached thin-film-transistor (TFT) screen measures and displays the results. Demonstrated applications include: (i) measuring the altered distribution of a cell population with a disease phenotype compared to a healthy phenotype, which is applied to sickle cell disease diagnosis, and (ii) separation of different cell types based on their characteristic densities, which is applied to separate white blood cells from red blood cells for white blood cell cytometry. These applications, as well as future extensions of the essential density-based measurements enabled by this portable, user-friendly platform technology, will significantly enhance disease diagnostic capabilities at the point of care.

Introduction

Hier stellen wir eine Technologie-Plattform und eine Technik, die Magnetschwebebahnen verwendet gekoppelt mit automatisierten Bildgebung und Analyse der Dichteverteilung von den Zellen eines Patienten als Indikator für die Krankheit zu analysieren. Dieser vielseitige Ansatz für dichtebasierte zytometrische Analyse kann letztlich zu einer Reihe von Krankheitsdiagnostik angewendet werden. Um jedoch mit Point-of-care-Tests und die Verwendung in Entwicklungsländern kompatibel zu sein, muss der Technik Anforderungen erfüllen zu niedrigen Kosten, Portabilität und Benutzerfreundlichkeit. Das Gerät und Verbrauchsmaterialien müssen leicht zu geringen Kosten erhalten werden. Die Probenvorbereitung muss einfach sein, Analyse sollte mit minimalen Anforderungen für die Benutzereingabe oder Interpretation automatisiert werden, und die Ergebnisse sollten schnell zurückgegeben werden. als nützlich in klinischen als auch den Entwicklungsländern weiteren muss das Gerät kompakt und tragbar sein. So haben wir eine Vorrichtung und ein Verfahren zu verwenden Magnetschwebebahn in Point-of-Care-kompatiblen technol entwickeltnologie durch Kopplung automatisierten Bildgebung und Bildanalyseergebnisse in Bezug auf die Dichteverteilung einer Population von den Zellen eines Patienten zurückzukehren.

Point-of-Care-Technologien bieten einen bemerkenswerten Vorteil gegenüber aktuellen klinischen Labortestverfahren. Die derzeit verfügbaren Technologie ist zu teuer durch einen Kliniker besessen zu werden oder zu komplex durch medizinisches Personal durchgeführt werden. Viele dieser Verfahren erfordern arbeitsintensive Protokolle, die von einem ausgebildeten Techniker durchgeführt werden müssen. Aus diesen Gründen werden Patientenproben wie Blut oder Urin im Allgemeinen in der Arztpraxis gesammelt dann transferiert zu einer entfernten, zentralen Prüflabor für klinische Tests, die mehrere Tage dauern für den Arzt können die Ergebnisse des Tests zu erhalten. Dies kann zu Verzögerungen führen oder Komplikationen im Verlauf der Behandlung in einigen Fällen macht diese Tests sehr teuer und ineffizient (eine finanzielle Belastung für die Versicherungszahler verursacht), und macht weiter vieleDiagnose unzugänglich in ressourcenarmen Einstellungen und Entwicklungsländern.

Hier stellen wir eine Magnetschwebetechnik gekoppelt mit automatisierten Bildgebung und Analyse sowohl in einer Vorrichtung mit eingebettetem Bildgebung und Verarbeitung (Abbildung 1) und einem Smartphone-kompatiblen Gerät (Abbildung 2). Diese Magnetschwebebahn-basierte Geräte repräsentieren eine breit anwendbare Plattformtechnologie, die das Potential hat, zu einer Reihe von verschiedenen medizinischen diagnostischen Anwendungen eingesetzt werden. Die Magnetschwebebahn Ansatz Funktionen basierend auf einem Gleichgewicht zwischen zwei Kräfte: eine magnetische Kraft und eine Auftriebskraft ^{1, 2, 3.} Wenn ein Teilchen in einem paramagnetischen Medium suspendiert und in einem Magnetfeld von zwei Magneten, deren gleichnamige Pole einander gegenüber, um eine magnetische Kraft wirkt auf die Teilchen in Richtung auf die Mittellinie zwischen den beiden magn erzeugt eingefügt ets. Die Auftriebskraft wird durch die relative Dichte des zu dem Suspensionsmedium verglichen Teilchen verursacht und ist nach oben in dem Fall von Teilchen weniger dicht als die mittlere und nach unten in dem Fall von Teilchen eine höhere Dichte als das umgebende Medium. Auf der Grundlage dieser beiden Kräfte, Partikel eine Gleichgewichtsschwebeposition in dem Feld zu erreichen, die diese beiden Kräfte ausgleicht; Diese Position ist direkt mit der Dichte des Teilchens, mit dichteren Teilchen niedriger im Bereich levitating als weniger dichte Teilchen. Ein Abbildungsmodul, entweder ein eingebautes in Smartphone – Kamera ^{4, 5, 6} oder unabhängige optische Komponenten mit einer Vergrößerungslinse ausgestattet ^{7, 8} werden verwendet , um die Positionen der Partikel sichtbar zu machen. Bildverarbeitung, entweder über eine Smartphone – Anwendung ^{4, 5,}= "Xref"> 6 oder ein eingebettetes Verarbeitungseinheit ^{7, 8,} verarbeitet dann die aufgenommenen Bilder der räumlichen Verteilung , und daher zu quantifizieren, die Dichteverteilung der Bevölkerung. Um nur einige interessierende Teilchen pro Milliliter größere Proben (wie diejenigen , zu analysieren, kann Strom direkt in die Vorrichtung integriert werden, die Partikel Levitation sind und wie sie sich durch den Abbildungsbereich (2) passieren analysiert.

Abbildung 1: Autarke Magnetic Levitation Plattform. (A) Compact Magnetschwebebahnen Vorrichtung mit einer magnetischen Fokussierungsmodul Abbildungskomponenten (eine Leuchtdiode (LED), eine optische Linse und einer Kamera – Detektor), und eine Verarbeitungseinheit mit einem Anzeigebildschirm. (B) Die magnetische Feldstärke in der cross-Abschnitt des Bereichs zwischen den Magneten, wenn die Probe eingeführt ist. Die Feldstärke ist am größten an der Oberfläche der Magneten und nähert sich Null an der Mittellinie zwischen ihnen. (C) Teilchen, wie Zellen, innerhalb der magnetischen Felderfahrung mehrere Kräfte: eine Magnetkraft (F _m) in Richtung der Mittellinie zwischen den Magnetics, mit Größe von der Position des Partikels Variierens basiert; eine Gravitationskraft (F _g ') , die auf der Partikeldichte relativ zu derjenigen des Suspensionsmediums und eine Widerstandskraft (F _d) Widerstand gegen die Teilchenbewegung abhängt. Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung aus Yenilmez, et al. ⁸ Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Feigeure 2: Smartphone-kompatibel Magnetic Levitation Platform Flow unterstützt. (A – c) Front (a), Seite (b) und zurück (c) Ansichten der Magnetschwebebahn Vorrichtung (d) Die Komponenten des Gerätes gehören: 1) der Magnetschwebetechnik – Modul, einschließlich Permanentmagneten, eine Vergrößerungslinse, und eine LED und Lichtdiffusor, 2) Smartphone Fall, 3) Elektronik, einschließlich eines Mikrocontrollers, Pumpentreiber und Bluetooth-Empfänger, 4) Mikropumpenhalter, 5) verstellbare Öffnung, 6) Abfallrohrhalter, 7) Batteriehalter, 8 ) Probenhalter, 9) Doppelzweck-Stand und Deckel. (E) schematisches Fluss, der Probe durch das Magnetfeld zeigt Pumpen. (F) Querschnitt des Magnetschwebemodul, das zeigt , wie Teilchen unterschiedlicher Dichten auszurichten , wie sie durch das Feld gepumpt werden; weniger dichte Teilchen, wie Partikel 1, wird bei einer höheren Schwebehöhe t äquilibrierenhan dichteren Teilchen, wie Teilchen 2. Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung aus Amin, et al. ¹ Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Die Mindestanforderungen für die Verwendung von jeder Probe für die Dichteverteilungsanalyse in diesem System umfassen die Fähigkeit, eine Suspension von Zellen oder Teilchen, die größer als etwa 5 & mgr; m und weniger zu erhalten als etwa 250 um in der Größe (für die Bildgebung und Bildverarbeitung), und seine Kompatibilität mit in einer Lösung eines paramagnetischen Lösungsmischen wie das Gadobutrol hier verwendet. Für die Krankheitsdiagnose umfassen kompatible Anwendungen solche, in denen (i) Zellen von Interesse von Natur aus eine veränderte Dichte aufweisen, wenn sie eine Erkrankung im Vergleich zu gesunden Kontrollen tragen, (ii) kann eine Dichteänderung in der Zelle durch Zugabe eines Reagens oder einige induziert werden Alternative Behandlung für eine kurze incubation Zeit, oder (iii) verschiedene Zelltypen werden in einer einzigen Probe identifiziert und von Natur (oder über irgendeine Behandlung) haben einzigartige charakteristische Dichten.

Sichelzellenanämie ist eine genetische Erkrankung eine mutierte Form von Hämoglobin verursacht, HbS, in eine Person , die roten Blutkörperchen (Erythrozyten) hergestellt werden, die in intermittierenden gefäßverschließenden Ereignisse und chronische hämolytische Anämie ⁹ führen kann. Es wird unter Verwendung von entweder Hämoglobin diagnostiziert isoelektrische Fokussierung, Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) Fraktionierung oder Hämoglobin Elektrophorese, die sehr genau sind, müssen jedoch in einem klinischen Testlabor durchgeführt werden, da sie mit Point-of-care-Einstellungen nicht kompatibel sind. Löslichkeit und papierbasierte Tests für die Sichelzellkrankheit wurden vorgeschlagen, aber erfordern in der Regel subjektive Benutzer Interpretation und Bestätigungstest. Hier verwenden wir eine dichtebasierte Ansatz Sichel RBCs zu identifizieren, die eine höhere Dichte als RB erreichenCs von Menschen ohne Sichelzellenkrankheit. Der Mechanismus beinhaltet Polymerisation der mutierten Form von Hämoglobin, HbS, die unter Bedingungen von Sauerstoff befreitem RBC Dehydratisierung in Sichelzellanämie verursacht RBCs ^{10, 11, 12, 13.}

Diese Dichte-basierten Ansatz kann auch angewendet werden , um Zellen verschiedener Typen auf der Basis der Dichte zu trennen: weiße Blutkörperchen (WBCs) und RBCs ^7. WBL sind in der Regel verantwortlich für Infektionen im Körper bekämpfen. WBC-Zytometrie kann verwendet werden, um die Zahl dieser Zellen im Blut zu quantifizieren, und dient als ein nützliches Diagnosewerkzeug. WBC zählt höher als normal (allgemein als mehr als 11.000 Zellen pro Mikroliter) können Infektionen, Erkrankungen des Immunsystems oder Leukämie hinweisen. WBC zählt unter dem normalen Bereich (etwa 3500 Zellen pro Mikroliter) können durch Autoimmunerkrankungen oder condit verursacht werdenIonen, die Schädigung des Knochenmarks. Im Gegensatz zu alternativen Technologien, präsentiert hier der Prozess verlässt sich nicht auf die Lyse der roten Blutkörperchen oder Flecken um WBCs zu identifizieren. Diese zellbasierten Test nutzt die einzigartigen inhärenten Dichten der beiden Zelltypen Trennung durchzuführen, da die WBC Populationsdichte der RBC Population , die niedriger sein berichtet wurde , als wie zuvor ^{3 2,} Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung von berechnet.

Im Vergleich zu alternativen Tests an entfernten Standorten, ist dieser Test schnell, mit einfachen Probenvorbereitung (3), die Trennung der Zellen in der Vorrichtung innerhalb von 10 bis 15 min, und die automatisierte Bildverarbeitung und Analyse , die weniger als 1 min erfordert. Auf diese Weise kann das Gerät Ergebnisse schnell wieder besser zu medizinischen Entscheidungen informieren, damit die Behandlung sofort verabreicht werden, physischen und psychischen Schmerzen zu lindern und das Risiko von Komplikationen associ reduzierenmit einer Verzögerung in der medizinischen Versorgung ATED. Diese Technik kann vor Ort entweder in klinischen Umgebungen durch einfache Probenaufbereitung und automatisierte-Bildgebung und Analyse durchgeführt werden, die ein Ergebnis mit einer minimalen Benutzereingabe oder Interpretation liefert. Aufgrund der Verwendung eines einfachen Ansatz Permanentmagneten für die Probenanalyse und die Verwendung von entweder einem Smartphone oder einfache elektrische Komponenten für die Bildverarbeitung und Bildverarbeitung, wobei die Vorrichtung sowie die per-Testkosten sind minimal im Vergleich zu einigen anspruchsvolle Testverfahren.

Protocol

Ethische Erklärung: Alle Verfahren menschlichen Blutproben beteiligt sind, wurden durchgeführt nach den institutionellen Regelungen. Alle Protokolle wurden vom Institutional Review Board überprüft und genehmigt. Eine informierte Zustimmung wurde von allen Teilnehmern gegeben. 1. Probenvorbereitung für die Sichelzellenanämie – Diagnose 5, 8 Bereiten Sie eine 50 mM Lösung von Gadobutrol in Hanks Balanced Salt Solution…

Representative Results

Für Verteilungsanalyse der Zelldichte, die die Technik zur Sichelzellenkrankheit Diagnose verwendet wird, ist das Ziel, die Breite der Verteilung der Zellpopulation zu identifizieren. Die Blutzellen von Patienten ohne Sichelzellkrankheit innerhalb einer vorhersagbaren Breite beschränkt werden. Zellen von Patienten mit Sichelzellkrankheit wird über einen weiteren Bereich mit einer nach unten gerichteten Schrägstellung in der Zellverteilung (siehe Abbildung 4) für ein…

Discussion

Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls
Kritische Faktoren in diesem Verfahren umfassen die richtige Ausrichtung der Magnete. Wenn die Magnete sich lösen oder getrennt mehr als normal in dem Gerät, kann dies Auswirkungen auf die Ergebnisse. Zu steuern, um diesen Fehler oder andere in dem Prozess, eine Dichte gesteuerten Teilchen, wie Polystyrol-Mikrokügelchen, kann periodisch für Veränderungen über die Zeit zu steuern, verwendet werden. Ferner ist Schwebezeit wichtig, damit die Zellen ein Gleichgewicht …

Materials

Gadavist (Bayer)	Jefferson Medical and Imaging	2068062	Gadavist contains 1M gadobutrol, a chelate of gadolinium. We purchased 2 mL vials with 15/ca.
Square glass microcapillary tubes	Vitrocom	8270	50 mm length is sufficient
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	S9000	Chemical formula: Na2S2O5
Leica Microsystems Critoseal tube sealant	Fisher Scientific	02-676-20
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	H9269 SIGMA
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	Or other reagent as recommended for the cell type used
MICROLET 2 Adjustable Lancing Device	Walgreens	246567	Any lancing device is acceptable when used according to biosafety protocols
Microlet Lancets	Walgreens	667474	Must be dispoable and not reused
Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer	Fisher Scientific	02-671-6	Or any preferred method for cell counting
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher	A1049201