Introduction
I løpet av de siste tiårene har den ekstracellulære matriks (ECM) bli anerkjent som en mangfoldig, dynamisk og komplekst miljø som er involvert i flere celle-fysiologiske og patologiske prosesser. På vev nivå, påvirker ECM cellesignalisering, bevegelighet, differensiering, angiogenese, stamcellebiologi, tumorigenesis, fibrose, etc. 1,2. Studiet av ECM organisasjon og ECM-avhengige prosesser har således bred implikasjoner for cellebiologi og vev fysiologi. For å nå en mekanistisk forståelse av ECM sammensetning, organisering, og funksjonelle egenskaper, metoder for nøyaktig isolering av ECM nødvendig. Mens den første identifikasjon av ECM-proteiner stoles på isolering fra vev 3, har fremstillingen av ECM fra dyrkede celler nå blitt mer utbredt.
Isolering og analyse av celle-avledet ECM er komplisert for to hovedgrunner. For det første, tilstedeværelse av celler ogir rikelig intracellulære proteiner kan gjøre det vanskelig å isolere den ECM som en diskret ekstracellulære struktur. Faktisk noen ECM-proteiner har roller inne i cellen, så vel som i ECM-4; Derfor er effektiv fjerning av intracellulære proteiner fra celleavledet ECM avgjørende hvis studiet av proteiner i ECM er ikke forveksles med sine roller inne i cellen. For det andre, er celle-avledet ECM sammensatt av mange store, oligomere proteiner, som ofte er kovalent tverrbundet ved ECM sammenstillingen, og som derfor er uoppløselig i vanlige vaskemidler. Disse egenskapene kan komplisere utvinning og videre analyse av ECM. For å løse disse problemene, kreves en metode som gjør det mulig effektiv separasjon av ECM proteiner fra cellulære komponenter.
Flere metoder er blitt beskrevet i litteraturen for isolasjon av ECM enten fra cellekultur eller vevsekstrakter. Mange av disse metodene er rettet mot utvinning av den rikelige ECM protein, kollagen, fra vev og inkluderer bruk av nøytrale salter 3, sure betingelser 5,6, eller pepsin 7. Isolering av total ECM fra vevsekstrakter innebærer ofte decellularization av vevet før isolering av ECM. For eksempel har en sekvensiell utvinning metoden blitt beskrevet som isolerer ECM fra humant hjertevev 8. Først ble det løst bundne ECM-proteiner ekstrahert med 0,5 M NaCl før natriumdodecylsulfat (SDS) ble anvendt for å fjerne cellene. Til slutt ble de gjenværende ECM-proteiner ekstrahert ved anvendelse av 4 M guanidin 8. ECM kan også bli oppløst fra decellularized prøver med 8 M urea 9. Andre teknikker gjør bruk av vaskemidler, slik som deoksykolsyre 10, for å trekke ut både celler og ECM før separering av uoppløselige ECM-proteiner fra det oppløselige cellelysat ved sentrifugering.
Fremgangsmåten for isolering og analyse av celle-avledet ECM som er beskrevet i denne rapporten gir en reproducible fremgangsmåte for å fjerne cellemateriale, slik at celle-avledet ECM som kan analyseres ved in situ immunofluorescens eller trukket ut for videre biokjemisk analyse. Denne fremgangsmåten kan tilpasses for en hvilken som helst vedheftende celletype og kan skaleres opp til nedstrøms prosedyrer, for eksempel immunblotting eller massespektrometri, eller for anvendelse av det isolerte ECM i funksjonelle studier. Fremgangsmåten kan også brukes i forbindelse med konfokal mikroskopi av levende celler for å spore ECM avsetning av et kodet protein av interesse i sanntid. Dette oppnås gjennom bruk av et rutenett, med glassbunn fatet. Totalt er den tilnærmingen en nøyaktig isolering av celle-avledet ECM og også omfanget til å identifisere og overvåke avsetning og dynamikken i enkelte ECM proteiner.
Protocol
1. Fjerning av celler med ammoniumhydroksidløsning
- Forbered heftende celler ved plating på passende tetthet.
MERK: Cellene kan være en hvilken som helst vedheftende celletype som produserer tilstrekkelig ECM for analyse. Her beskriver vi bruken av COS-7-celler, afrikansk grønn ape nyre fibroblast-lignende cellelinje som inneholder SV-40 virus-DNA-sekvenser; RCS, en rotte chondrosarcoma cellelinje; eller normal menneskelig dermal fibroblast (HDF) stammer fra juvenil forhuden. HDF brukes fra passasjen 1 til passasjen 8 bare.- Plate cellene på dekkglass for avbildning av levende celler og ECM, for fluorescens mikroskopistudier av faste ECM, eller for fremstilling av celle-avledet ECM for småskala funksjonelle analyser. Plate cellene på cellekultur retter for SDS-PAGE analyse, immunoblot, eller proteomikk studier.
MERK: celledyrkningsbetingelser The (antall celler til plate og kulturmedium) vil avhenge av celletype. Celletallet til platen måetableres empirisk for den aktuelle cellelinje eller cellestamme. - Tillate en passende tid for å få cellene til å sette ECM, typisk> 16 timer. MERK: Tidsperioden vil avhenge av celletype og må bestemmes empirisk. Ved gjennomføring av ektopisk ekspresjon, tillate passende tidspunkt for ekspresjon av det transfekterte proteinet av interesse, og for avsetning av ECM.
- Plate cellene på dekkglass for avbildning av levende celler og ECM, for fluorescens mikroskopistudier av faste ECM, eller for fremstilling av celle-avledet ECM for småskala funksjonelle analyser. Plate cellene på cellekultur retter for SDS-PAGE analyse, immunoblot, eller proteomikk studier.
- I en avtrekksvifte, Forbered 20 mM ammoniumhydroksid i et egnet kar ved å fortynne lagerløsning 1/14 med De-ionisert H 2 O.
- Fjerne cellene fra inkubatoren og forsiktig fjerne kulturmediet. Legg fosfat-bufret saltvann (PBS) uten Ca 2+ / Mg 2+ ved å forsiktig helle mot veggene i fatet. Rock parabolen to ganger og fjerne væsken med en plast overføringspipetten. Gjenta to ganger mer.
- I en avtrekksvifte, vippe hver tallerken og fjerne PBS fra trinn 1.2 med en plast overføringspipetten. Legg 3ml ammoniumhydroksyd pr 100 mm skål og inkuber dem ved romtemperatur i 5 min. I løpet av fem minutters inkubasjonstid, forsiktig omrøre fatet hver min for å sikre at lysis av alle cellene. Trinn 1.4 til 1.7 vil også bli utført i avtrekkshetten.
MERK: Alternativt celle fjerning av reagenser innbefatter to M eller 8 M urea, som ble inkubert med cellene i 10 min. - Legg rikelige mengder avionisert H 2 O til hver rett, minst 20 ml per 100 mm skål, med rock. Kast den ammoniumhydroksyd-solubilisert materiale-som er sammensatt av ammoniumhydroksyd, lyserte celler, og de-ionisert H 2 O-ved aspirering med en overføring pipette. Overføre denne avfallsløsningen i en beholder for flytende avfall.
- Vask den uoppløselige ECM laget i rikelig deionisert H2O fire ganger for å sikre fullstendig fjerning av alle ammoniumhydroksyd-oppløseliggjort materiale.
- For undersøkelse av ECM ved immunfluorescens, fikse ECM ved å legge til 2%paraformaldehyd (PFA, 3 ml pr 100 mm skål) ved romtemperatur i 10 minutter.
Forsiktig: PFA er svært farlig i tilfelle av hud eller øyekontakt og alvorlig overeksponering kan produsere lungeskade, choking, bevisstløshet eller død. Det bør bare håndteres i en avtrekksvifte og personlig verneutstyr skal brukes. - Vask hver fast prøven to ganger med PBS, som i trinn 1.2, og kast den PFA løsning i en egnet flytende avfallsbeholder. Om nødvendig, lagre ECM prøvene i PBS ved 4 ° C før forbereder dem for fluorescens mikroskopi.
2. Sporing Nedfall av en ECM Protein av konfokalmikroskopi Imaging av levende celler
- Telle cellene under et hemocytometer. For COS-7 celler, plate 250.000 celler på en 60 mm cellekultur parabolen for transfeksjon.
MERK: For levende celle bildebehandling, cellene må transfektert med en vektor som koder for ECM protein av interesse, smeltet i ramme med en genetisk kodet fluorescent tag. Dette er for å muliggjøre identifisering av ECM protein av interesse under live-cell imaging. - Etter en passende tid for proteinekspresjon (for eksempel 16 h) fjerne cellene fra fatet med trypsin-EDTA-oppløsning, telle dem i et hemocytometer, og plate ~ 150.000 celler på en 35-mm gridded, glassbunn tallerken for avbildning. Tillat 2 timer for å få cellene til å feste og å begynne ECM nedfall (tidsperioden vil avhenge av celletype og må etableres empirisk).
MERK: Bruk en celle medium som ikke inneholder fenol rødt, da dette kan gi et rødt skjær som påvirker bildekvaliteten. - Under de ovennevnte to timers periode, sette opp et konfokalt mikroskop med en 37 ° C inkubator kammer og en CO 2 forsyning. At temperaturen i kammeret og i fatet for å stabilisere til 37 ° C før avbildning; Dette kan ta opptil en time.
- Inkuber cellene sådd ut på 35 mm gridded tallerken med en fluoriserende markør celle i 30 min. Deretter vaske celleneto ganger i fenolrødt-fritt kulturmedium før avbildning.
MERK: En cytoplasmatisk fluoriserende markør kan anvendes for å visualisere cellevolum, eller en membran som omfatter markør kan anvendes for å visualisere celle kanter. - Bruke 20X objektiv og fasekontrast på et konfokal mikroskop, identifisere en passende rutenett som inneholder et tall (> 3) av tilhenger, friske celler. Bekrefte ekspresjon av målproteinet av valg i cellene innenfor den valgte rutenett ved hjelp av 63X eller 100X mål og de aktuelle bølgelengder i henhold til fluorescens mikroskopi.
- Sett opp fluorescens og fasekontrast time-lapse avbildning ved hjelp av en z-stack programvare. Sett "begynner" stack til å være like under ECM laget og "End" stack til å være like over cellen kroppen. Still z-trinnstørrelsen til 0,3 um og z-volumet til mellom 5 og 10 um dybde totalt, avhengig av celletypen. Dette vil gi mellom 15-30 z-snitt per tidspunkt.
- Capture fluorescens (for rød fluorescerende protein (RFP), eksitasjon = 555 nm og emisjon = 584 nm) og fase-kontrast med jevne mellomrom over en gitt tidsperiode. For eksempel bruke time-lapse programvare for å angi tidsintervallet på 2 min og varigheten til 2 timer. Velg "Start" -knappen for å starte fangst av z-seksjon bilder over den definerte tidsperioden.
- Ved slutten av tidsperioden, fjernes cellene fra fatet, slik det er beskrevet i trinn 1,1-1,5, for å bekrefte lokaliseringen av det fluorescens-merkede proteinet av interesse i ECM.
- Bruk fase-kontrast bildebehandling og 20X mål å flytte den aktuelle rutenett.
- Bytt til 63X objektiv og identifisere ECM laget under fluorescens mikroskopi. Sammenlign dette bildet til pre-utvinning bilde
3. Sterilt Utarbeidelse av Cell-avledet ECM for Cell funksjonelle analyser
- Grow en populasjon av celler ( "Matrix produsent" celler) på dekkglass og en annen befolkforordning ( "test" celler) i standard kultur i en 100 mm cellekulturskål i minst 24 timer.
MERK: Disse kan være noen to forskjellige tilhenger celletyper, og den eksperimentelle design kan inkludere transfeksjon av en eller begge cellepopulasjoner å uttrykke en fluorescently-merket ECM protein. - I en laminær strømningshette, som anvendes for cellekultur, fremstille sterile løsninger av PBS uten Ca2 + / Mg2 +, 20 mM ammonium-hydroksid (se trinn 1.3), og deionisert H2O ved å føre hver gjennom et sterilt 0,2 um filter inn i en egnet steril beholder.
- Opprettholde steril teknikk, forsiktig vaske "Matrix produsent" celler på dekk tre ganger med sterilt PBS (se trinn 1.2).
- Fjern PBS ved aspirasjon med en steril pipette og kaste den i en passende flytende avfallsbeholder. Tilsett 20 mM steril ammoniumhydroksyd (3 ml / 100 mm skål) og inkuber dem i 5 minutter med gynge i intervaller.
- Legg rikeligsterilt deionisert H2O til "matrise produsent" antenne, minst 20 ml pr 100 mm skål, med gynge og øse bort cellelysatet i en egnet avfallsbeholder.
- Gjenta trinn 3.5 fire ganger for å sikre fullstendig fjerning av ammoniumhydroksyd-oppløseliggjort materiale.
MERK: ECM avsatt av "Matrix produsent" celler på glassene gir deretter en steril ECM for funksjonelle analyser med noen testcellene av interesse. - Inkuber test celler fra cellelagerskål med 1,5 ml trypsin-EDTA-oppløsning pr 100 mm skål (0,05 vekt / volum% trypsin og 0,02% w / v EDTA i Hanks balanserte saltoppløsning) inntil testcellene blir løsrevet fra fatet . Legg celle medium, sentrifuger testcellene ved 400 xg i 5 minutter, og fjerne den overliggende væske.
- Suspender testcellene i friske, sterilt medium og telle dem på en hemocytometer. Plate et passende antall av disse testceller på sterile, isolert ECM på coverslips. Kultur dem i den aktuelle cellemedium i 2-3 timer, eller for den tidsperioden som kreves for eksperimentell design.
- For å undersøke organiseringen av aktin cytoskjelettet, løse testcellene i 2% PFA og beis dem med fluorescein-isotiocyanat (FITC) -phalloidin (eksitasjon = 490 nm og emisjon = 525 nm) for å visualisere F-aktin og med 4 ', 6 -diamidino-to-phenylindole (DAPI; eksitasjon = 358 nm og emisjon = 461 nm) for å visualisere kjerner 11.
MERK: Sammenlign morfologi og aktin organisasjon i testcellene belagt på heterologe celle-avledet ECM med testcellene belagt på egenhånd ECM.
4. Isolering av ECM for SDS-PAGE, Immunanalyse, eller Proteomikk
- Grow heftende celler av interesse på 100 mm cellekulturskåler (5 til 10 retter for proteomikk eller 1-2 retter for immunoblotting) for 24-96 timer, avhengig av hvilken celletype, for å tillate utskilling og deponering av ECM.
- Fjern cellene som descrIbed i trinn 1,1-1,5.
- Vippe hver plate i en vinkel for å tømme rest H 2 O til bunnen av fatet, og fjern forsiktig eventuelt gjenværende H 2 O med et P200 pipette inntil platen er helt tørr.
- Parallelt varme SDS-PAGE prøvebuffer som inneholdt 100 mM ditiotreitol (DTT) til 95 ° C i 2 min ved hjelp av en varmeblokk, og deretter legge den til plate. 200 ul prøvebuffer pr 100 mm skål er egnet for prøvene som skal undersøkes ved immunblot.
- For å analysere ECM ved massespektrometri, for å oppnå et mer konsentrert prøve ved oppsamling av SDS-PAGE-prøvebuffer fra fatet (som beskrevet i trinn 4.5 og 4.6, nedenfor), re-oppvarming til 95 ° C, og ved hjelp av den samme delmengde på tvers 2-3 ekstra plater.
- Bruk en celle skrape til grundig skrape av ECM fatet, noe som sikrer at alle deler av fatet har blitt skrapet.
- Med celleskraper, samles prøven til den ene siden av fatet, og fjerne den med et 200mL pipette tips til et rør.
- Overføre eventuelle gjenværende SDS-PAGE-prøvebuffer ekstrakt fra cellen skrapespissen inn i røret for å minimere tapet av ECM materiale. For en konsentrert prøve, re-heat samme SDS-PAGE prøvebuffer delmengde til 95 ° C og re-bruke det over 2-3 flere plater.
- Løse ECM proteiner ved SDS-PAGE 12, enten ved hjelp av 7% eller 4-7% gradient polyakrylamidgeler.
MERK: Det er praktisk å bruke pre-farget proteinmarkører. - For å øke oppløsningen av høy molekylvekt ECM-proteiner, forlenge gelen driftstid slik at 37 kDa molekylvektmarkør den løper nær bunnen av gelen og molekylvektmarkører <37 kDa har kjørt av gelen.
- For proteomikk analyse av ECM proteiner, beis gel med et protein flekken og ta et bilde. Skjær bånd av interesse fra gelen, fordøye dem med trypsin, og analysere dem ved matriks-assistert laserdesorpsjon / ionisering (MALDI) vekt- spektrometri <sup> 13.
- Alternativt, for en mer omfattende analyse av ECM ekstrakt og å analysere hele utvalget, skjære gelen kjørefelt i seksjoner, fordøye dem med trypsin, og utføre væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) 14.
- Alternativt, for immunoblotting 15, overfører proteiner fra SDS-PAGE-gel på polyvinylidenfluorid (PVDF) membran ved 15 V i minst 1 h 10 min (semi-tørr-metoden) for å sikre overføring av de med høy molekylvekt ECM-proteiner . Visualisere det totale proteinet overført til membranen med en Ponceau S flekk.
- Etter trinnet 4.11, bruke antistoffer til å etablere tilstedeværelse og / eller foreta en semi-kvantitativ analyse av de enkelte ECM-proteiner 15.
- Blokkere membranen med 2% (w / v) melk i TBS-Tween 20 (blokkeringsbuffer) over natten ved 4 ° C. Fortynn spesifikke antistoffer til ECM-proteiner i blokkeringsbuffer og inkuber med membranen i 1,5 timer ved romtemperatur (antistoff til fibronectin fortynnet 1/600 og antistoff mot thrombospondin-en fortynnet 1/150; Utfyllende tabell 1).
- Teste kvaliteten av ECM isolasjon ved å re-undersøkelser av samme blott med antistoffer mot rikelig intracellulære proteiner, så som aktin eller tubulin (anti-actin fortynnet 1 / 10.000 og anti-tubulin fortynnet 1 / 5.000).
Representative Results
Protokollen er beskrevet i trinn 1,1-1,5 handlinger for å fjerne celler og la bak celle-avledet ECM. Protokollen ble utført på COS-7 celler dyrket i 96 timer på dekkglass, og den celle-avledet ECM ble analysert ved fluorescens mikroskopi. Den ammoniumhydroksyd behandling fjernes cellene effektivt, som etablert ved tap av cellekjerner og aktin cytoskjelettet, ifølge DAPI og phalloidin flekker, henholdsvis (figur 1). Utvinningen av celler med 2 M urea var ikke så effektiv som ammoniumhydroksyd; spor av DAPI og phalloidin-farging ble påvist etter behandling. 8 M urea hadde en lignende virkning på ammoniumhydroksyd (figur 1). Deretter ble celle-avledet ECM visualisert før og etter ammoniumhydroksyd behandlingen (trinn 2.1 til 2.11). COS-7-celler ble transfektert med et monomert rød fluorescerende protein (mRFP) -tagged trombospondin-1 C-terminal trimer, (mRFPovTSP1C) 11 og dyrket på en 35 mm tallerken med en gitter glass base.
To timer etter plating, en passende rutenett kvadrat som inneholdt flere friske celler uttrykker mRFPovTSP1C ble visualisert under en konfokal mikroskop. En referansefasekontrast Bildet ble tatt av dette området, og deretter fluorescens time-lapse imaging ble gjennomført hver 1 min til 2 timer (Figur 2A). Cellene ble deretter fjernet ved hjelp av ammonium hydroksid, og det samme rutenett på fatet ble flyttet under fase kontrast og deretter analysert ved fluorescens mikroskopi. Cellene var ikke lenger til stede i rutenett, men mRFPovTSP1C forble innenfor ECM, oppdages av fluorescens mikroskopi som karakteristisk puncta (figur 2A). Enhver mRFPovTSP1C deponert i ECM før cellefjerning ble identifisert ved å sammenligne det fluorescensmønster man før og etter fjerning av celler. Den fluorescerende puncta identifisert i begge bildene (Figure 2A, f.eks pilen) er inferred å være assosiert med ECM.
Ammoniumhydroksyd behandling ble deretter brukt til å isolere naturlig ECM fra dyrkede, adherente celler. Humane dermale fibroblaster (HDF) ble dyrket på dekkglass i 96 timer. Celler ble fjernet ved anvendelse av ammoniumhydroksyd, og den ECM ble probet med et anti-kollagen-antistoffer, som viste et karakteristisk fibrillært og nettvaren fargemønster 16 (figur 2B). Fibronektin mønster ble undersøkt omkring faste, ikke-permeabiliserte rotte kondrosarkom celler (RCS) og innen ECM etter fjerning av RCS celler (figur 2C). Den ammoniumhydroksyd isolering av ECM ble også utført under sterile betingelser, slik at "test" celler kan være re-platet på ECM for fenotypiske og funksjonelle studier. For eksempel "test" COS-7 celler ble sådd i 2 timer på sterile ECM produsert av RCS celler, og thøne de ble løst, permeabilized, og analysert for F-aktin organisasjonen ved FITC-phalloidin flekker, sammenlignet med COS-7 celler som produserer sin egen ECM (trinn 3,1-3,9) (figur 3).
I større målestokk, ble metoden anvendt for å isolere ECM for biokjemiske prosedyrer. For eksempel ble RCS celler dyrket på to 100 mm cellekulturskåler i 7 dager, og prosedyrene i trinn 4.1-4.7 ble fulgt. Proteiner i celleavledet ECM ble samlet ved å skrape dem inn i varm SDS-PAGE prøvebuffer og ble separert ved SDS-PAGE på en 7% polyakrylamidgel under reduserende betingelser. Gelen ble farget for protein, og de fire hovedbånd ble hvert isolert og analysert ved hjelp av massespektroskopi (figur 4A). En rekke av ECM-proteiner, inkludert fibronektin, trombospondin 1 (TSP1), trombospondin 5 / brusk oligomert matriseprotein (TSP5 / COMP), og matrilin-1 ble identifisert (figur 4B).
Alternativt kan mindre skala preparater av ECM vurderes av immunoblot. For eksempel, celle-avledet ECM fra COS-7-celler som uttrykker ectopically mRFPovTSP1C ble separert ved SDS-PAGE, overført til en PVDF-membran, og probet for RFP med et anti-RFP-antistoff (figur 4C). Denne teknikken er følsom nok til å detektere forskjeller i avsetnings mellom en opprinnelig trimer av TSP1 (mRFPovTSP1C) og en konstruert pentamer av TSP1 C-terminale område (mRFP-TSP-5-1C) 17 (figur 4C). For å undersøke den endogene ECM av HDF, ble tilstedeværelse av spesifikke proteiner i cellelysat eller den isolerte ECM undersøkt ved immunblotting. Den karakteristiske ECM proteiner fibronektin og thrombospondin-1 ble påvist i ECM, mens de rike intracellulære proteiner α-tubulin og β-aktin var fraværende fra det isolerte ECM (figur 4D).
Figur 1: Sammenligning av Methods of Cell fjerning. COS-7-celler ble dyrket ved høy tetthet i 96 timer på dekkglass, fiksert i 2% PFA, og permeabilisert i 0,5% Triton X100, eller ble behandlet som angitt for cellefjerning. Dekk ble deretter farget med FITC-phalloidin å visualisere F-aktin og DAPI å visualisere kjerner. Scale bar = 25 mikrometer. Dette tallet er endret fra en opprinnelig publisert i Journal of Cell Science 11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Identifikasjon av ECM proteiner i Isolert ECM. (A) Fase-kontrast og fluorescens bilder avCOS-7-celler som uttrykker mRFPovTSP1C og dyrket på en 35 mm skål med en glass-bunn, gitter utgangspunkt i 2 timer. Bilder er vist før og etter fjerning av cellene ved ammoniumhydroksyd. Kanten av rutenettet brevet er angitt i fase kontrast med en stiplet linje. Hvite piler indikerer eksempler på fluorescerende puncta som var til stede før og etter celle fjerning. (B) Påvisning av kollagen jeg i HDF ECM ved indirekte immunfluorescens. HDF ble dyrket i 96 timer, og fjernes med ammoniumhydroksyd, og den ECM ble farget for human fibrillær kollagen I. ECM ble også farget med FITC-konjugert anti-kanin-sekundært antistoff alene. (C) Lokalisering av fibronektin rundt RCS celler eller innenfor isolert RCS ECM, som detektert ved indirekte immunfluorescens. RCS-celler ble dyrket i 48 timer, fiksert i 2% PFA, og farget for fibronektin og med DAPI. I parallelle retter ble cellene fjernes med 20 mM ammonium hydroksid og ECM ble farget for fibronectin og med DAPI. Celler ble også farget med FITC-konjugert anti-mus IgG-antistoff alene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Bruk av steril ECM for funksjonelle studier. RCS "matriseprodusent" celler ble dyrket i 48 timer på dekkglass og deretter behandlet med 20 mM ammonium-hydroksyd under sterile betingelser for å fjerne cellene. COS-7 "test" celler ble sådd ut på dekkglass, med eller uten isolert RCS ECM i 2 timer, fiksert i 2% PFA, permeabilisert i 0,5% Triton X100, og farget med FITC-phalloidin å visualisere F-aktin og DAPI å visualisere kjerner . COS-7 celler belagt på RCS ECM spre mer omfattende og dannet store filament bunter (f.eks pilen) og kanten rysjerles. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Identifisering av proteiner fra Isolert ECM ved SDS-PAGE, massespektrometri, eller Immunoblotting. (A) RCS-celler ble dyrket i 7 dager og fjernes med 20 mM ammonium-hydroksyd; ECM ble skrapt opp i varm SDS-PAGE-prøvebuffer inneholdende 100 mM DTT. ECM-preparat ble separert ved SDS-PAGE på en 7% polyakrylamidgel under reduserende betingelser. Fire signifikante bånd (piler 1-4), ble identifisert ved proteinfarging. (B) Proteiner fra RCS ECM båndene 1-4 ble identifisert ved MALDI massespektrometri. (C) COS-7-celler som uttrykker enten mRFPovTSP1C (trimer) eller mRFP-TSP-5-1C (pentamer) ble dyrket i 48h og fjernes med 20 mM ammonium-hydroksyd, og den var ECM isolert i varm SDS-PAGE-prøvebuffer inneholdende 100 mM DTT. ECM-preparat ble separert ved SDS-PAGE på en 7% polyakrylamidgel under reduserende betingelser, overført til en PVDF-membran, og probet med et anti-RFP antistoff. Dette panelet er endret fra en opprinnelig publisering i Bioscience Reports 17. (D) HDF ble dyrket i 96 timer og deretter behandlet enten med 2% deoksykolsyre i PBS (cellelysat) eller med 20 mM ammonium-hydroksyd for å fjerne cellene. ECM ble skrapt inn i varm SDS-PAGE prøvebuffer. De to fraksjonene ble separert ved SDS-PAGE på en 10% polyakrylamidgel under reduserende betingelser, overført til en PVDF-membran, og probet med antistoffer, som angitt. I hvert panel, blir posisjonene av molekylvektmarkører indikert i kDa. Klikk her for å se en større versjon av dette figur.
Discussion
Kritiske trinn i protokollen
Metoden har noen viktige skritt som må følges for å sikre en vellykket isolering og analyse av ECM. For eksempel er ammoniumhydroksyd brukes til å fjerne cellene og for å isolere ECM for analyse. Selv om ammoniumhydroksyd er stabil i vandige oppløsninger i mørket og kan lagres ved romtemperatur, flasker må være tett på nytt forseglet mellom hver bruk. På grunn av at gassen kan fordampe fra oppløsningen, og dermed redusere konsentrasjonen, anbefaler vi igang en ny flaske hver 6-8 uker. I tillegg bør arbeidsløsningen gjøres ferskt for hvert eksperiment. Det er også viktig at cellene er fullstendig fjernet med rikelige vaskinger i de-ionisert vann. Hvis disse trinnene ikke er utført tilfredsstillende, kan cellemateriale forbli på fatet og forurense nedstrøms analyser. Når cellene er blitt dyrket i 10 dager eller lengre, kan ytterligere vannvaskinger være nødvendig. Det er viktig å note at det isolerte ECM laget er vanligvis svært tynn i forhold til cellene 11, slik at behandling er nødvendig når identifisering av ECM under avbildning. For effektiv ekstraksjon av det isolerte ECM inn i SDS-PAGE-prøvebuffer, er det viktig at prøvebufferen inneholder et reduksjonsmiddel. For den mest effektive fjernelse av ECM, må kokende varm-prøvebuffer anvendes. For eksperimenter hvor ECM prøvene vil bli løst ved hjelp av SDS-PAGE elektroforese for proteinfarging eller proteomikk, er det avgjørende for å oppnå en konsentrert prøve ved skraping av flere plater-verdi av ECM inn i den samme delmengde av prøvebuffer.
Modifikasjoner og feilsøking
Produksjon og sekresjon av ECM-proteiner kan variere betydelig mellom celletyper, så tidsperioder for sekresjon og avsetning av ECM bør bestemmes de novo for hver celletype. Det er også viktig å være klar over at ECM sammensetning vil endre seg dynamisk i forhold to celletetthet og tid i kultur 18. Denne faktoren bør tas hensyn til ved utformingen eksperimenter. Det er klart at valget av en celletype for denne metoden viktig, spesielt når utpakking ECM for analyse med massespektrometri, som kan kreve en betydelig mengde av den totale ECM protein.
Begrensninger av teknikken
Celler som utskiller meget lave nivåer av ECM-proteiner vil være mer utfordrende for bruk med denne fremgangsmåte. Ikke-adherente celler, 3D-cellekulturer, eller celle invasjon assays er uegnet for tiden for ECM isolert ved denne metoden. Den metode som er mest egnet for bruk med standard "to-dimensjonale" cellekulturer. På grunn av at ammoniumhydroksyd ekstraksjon fjerner cellene fullstendig, ECM forbundet med de øvre sider av celler og utskilt, men ikke-tverrbundet, er ECM-proteiner også fjernet, og etterlater på fatet et tynt lag av sammensatt ECM fra under og rundt fotstykkene av cellene 11,17
Betydningen av Technique For eksisterende / alternative metoder
Evnen til å utføre en lang rekke forsøk med isolert ECM er viktig i sammenheng med cellebiologi og vev fysiologi, og det har også implikasjoner for feltene vev regenerering og regenerering av vev. Metoden har fordeler sammenlignet med geler som dannes fra rensede kollagener eller andre rensede ECM-proteiner i at cellene sammen komplekse ECM-strukturer ved deres opprinnelige størrelse, med native tverrbindingsmekanismer og med individuelle ECM-proteiner til stede i forhold som passer til den celletypen opprinnelse. For eksempel, proteomikk studie av RCS ECM demonstrert rikelig matrilins og COMP / TSP5, som forventet foren brusk ECM 19,20 (figur 4). Generelt er analyse av celle-avledet ECM hemmet av sin natur som en omfattende, multi-protein nettverk som resulterer i kovalent tverrbinding og uoppløseligheten av mange ECM-proteiner, og også av den potensielle forurensning av ECM-ekstrakter med intracellulære proteiner. En multi-trinns fremgangsmåten, er utformet for å isolere den ECM fraksjonen fra vev for proteomikk analyse ga 8% av ECM-proteiner i det samlede sett av proteiner identifisert 21. Imidlertid peptider fra ECM-proteiner var 73% av de totale peptider identifisert. Denne fremgangsmåten for isolering og analyse av celle-avledet ECM hurtig og sikkert og pålitelig cellemateriale, men samtidig beholde ECM-proteiner. Denne fremgangsmåten kan anvendes for en rekke celletyper og nedstrøms applikasjoner og letter analysen av ECM biologi og celle-ECM-interaksjoner i cellekultur. Våre protokoller detalj hvordan fremgangsmåten kan anvendes på forskjellige skalaer for å håndtere et bredt spekter av experimental spørsmål med hensyn til ECM organisasjon, dynamikk, eller blanding, og til de funksjonelle virkningene av isolerte ECM på celler.
Fremtidige søknader eller Veibeskrivelse Etter å mestre denne teknikken
Se fremover, kan metoden være tilrettelagt for bruk med 3D-cellekulturer; dette ville utvide sin fysiologiske relevans. Decellularized innfødte vev har et stort potensial som et stillas for regenerering av tapt eller skadet vev og som et alternativ til transplantasjon, for eksempel etter hjertesvikt 22. Det har potensiale til å overvinne problemene med donor tilgjengelighet og immunorejection. Fremtidige anvendelser av fremgangsmåten som er beskrevet i denne rapporten kunne undersøke bruken med 3D-cellekulturer eller vev decellularization, noe som vil ytterligere øke omfanget av denne tilnærmingen.
Acknowledgments
Vi er mest takknemlig til Dr. Belinda Willard, proteomikk og Metabolomics Laboratory, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, for å gjennomføre proteomikk analyse av RCS ECM. Vi erkjenner økonomisk støtte fra theMedical Forskningsrådet UK, gi nummer K018043, til JCA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody to COL1A1 | Novus | NB600-408 | Rabbit polyclonal. Reacts with other fibrillar collagens as well as collagen I. IF: 1/200 |
| Antibody to fibronectin | Sigma | F3648 | Rabbit polyclonal. WB: 1/600 for 1.5 h. IF: 1/200 |
| Antibody to thrombospondin 1 | ThermoFisher | MA5-13398 | Mouse monoclonal clone A6.1. WB: 1/150 for 1.5 h |
| Antibody to RFP | Abcam | ab62341 | Rabbit polyclonal. WB: 1/2,000 for 2 h |
| Antibody to β-actin | Sigma | A1978 | Mouse monoclonal clone AC-15. WB: 1/10,000 for 1.5 h |
| Antibody to α-tubulin | Sigma | T9026 | Mouse monoclonal clone DM1A. WB: 1/5,000 for 1.5 h |
| Cell Tracker Green | ThermoFisher | C2925 | Fluorescent cell marker. Use at 1 µM for 30 min |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-Phalloidin | Sigma | P-5282 | Stock = 50 mg/mL in DMSO. 1/50 for 45 min |
| FITC-conjugated goat anti-mouse IgG | Sigma | F8771 | IF: 1/50 for 1 h |
| FITC-conjugated sheep anti-rabbit IgG | SIgma | F7512 | IF: 1/50 for 1 h |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG | LI-COR | 926-80010 | WB: 1/50,000 for 1 h |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG | LI-COR | 926-80011 | WB: 1/100,000 for 1 h |
| Vectorshield mounting medium with DAPI | Vector | H-1200 | Store at 4 °C in the dark |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D6429 | Warm before use |
| Fibroblast growth medium | PromoCell | C-23010 | Warm before use, supplement with 50 µg/mL ascorbic acid |
| Phenol red-free DMEM | ThermoFisher | 21063-029 | Warm before use |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | Warm before use |
| Gridded glass-bottomed dish | MatTek | P35G-2-14-C-GRID | |
| NH4OH, 28-30% solution | Sigma | 221228 | Dilute to 20 mM in de-ionised water. Once opened store in the dark, tightly capped. |
| Paraformaldehyde, 16% solution | Alfa Aesar | 43368 | Dilute to 2% (v/v) in PBS |
| Deoxycholic acid | Sigma | D2510 | Use at 2% (v/v) final concentration |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Dilute to 0.5% (v/v) final concentration |
| GelCode Blue stain reagent | ThermoFisher | 24590 | Protein stain for SDS-PAGE gels |
| Precision Plus protein standards | Biorad | 161-0374 | Protein standards for SDS-PAGE gels |
| Trans-Blot SD Semi Dry transfer cell | Biorad | 1703940 | Efficient transfer of high molecular weight proteins |
| PVDF transfer membrane | Millipore | ISEQ00010 | Immobilon-PSQ |
| Ponceau S stain | Sigma | P7170 | Reversible protein stain for PVDF membrane |
| WesternSure Enhanced chemiluminescence (ECL) substrate | LI-COR | 926-80200 | |
| High performance chemiluminescence film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Sterile filtration unit, MILLEX-GV | Millipore | ML481051 | |
| SP8 AOBS confocal laser scanning microscope | Leica | Environmental chamber needed for temperature and CO2 control (Life Imaging Services) | |
| Key: IF, Immunofluorescence; WB, Western Blot | |||
References
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 786-801 (2014).
- Hynes, R. O., Naba, A. Overview of the matrisome--an inventory of extracellular matrix constituents and functions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, a004903 (2012).
- Gross, J., Highberger, J. H., Schmitt, F. O. Extraction of Collagen from Connective Tissue by Neutral Salt Solutions. Proc Natl Acad Sci U S A. 41, 1-7 (1955).
- Hellewell, A. L., Adams, J. C. Insider trading: Extracellular matrix proteins and their non-canonical intracellular roles. Bioessays. 38, 77-88 (2016).
- Li, D., Yang, W., Li, G. Y. Extraction of native collagen from limed bovine split wastes through improved pretreatment methods. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 83, 1041-1048 (2008).
- Strawich, E., Nimni, M. E. Properties of a collagen molecule containing three identical components extracted from bovine articular cartilage. Biochemistry. 10, 3905-3911 (1971).
- Kim, B. S., et al. Human collagen isolated from adipose tissue. Biotechnol Prog. 28, 973-980 (2012).
- Barallobre-Barreiro, J., Didangelos, A., Yin, X., Domenech, N., Mayr, M. A sequential extraction methodology for cardiac extracellular matrix prior to proteomics analysis. Methods Mol Biol. 1005, 215-223 (2013).
- Carter, W. G. Transformation-dependent alterations is glycoproteins of extracellular matrix of human fibroblasts. Characterization of GP250 and the collagen-like GP140. J Biol Chem. 257, 13805-13815 (1982).
- Sechler, J. L., Takada, Y., Schwarzbauer, J. E. Altered rate of fibronectin matrix assembly by deletion of the first type III repeats. J Cell Biol. 134, 573-583 (1996).
- Adams, J. C., Bentley, A. A., Kvansakul, M., Hatherley, D., Hohenester, E. Extracellular matrix retention of thrombospondin 1 is controlled by its conserved C-terminal region. J Cell Sci. 121, 784-795 (2008).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Hillenkamp, F., Karas, M. Mass spectrometry of peptides and proteins by matrix-assisted ultraviolet laser desorption/ionization. Methods Enzymol. 193, 280-295 (1990).
- Davis, M. T., et al. Automated LC-LC-MS-MS platform using binary ion-exchange and gradient reversed-phase chromatography for improved proteomic analyses. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 752, 281-291 (2001).
- Burnette, W. N. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).
- Soucy, P. A., Werbin, J., Heinz, W., Hoh, J. H., Romer, L. H. Microelastic properties of lung cell-derived extracellular matrix. Acta Biomater. 7, 96-105 (2011).
- Hellewell, A. L., Gong, X., Scharich, K., Christofidou, E. D., Adams, J. C. Modulation of the extracellular matrix patterning of thrombospondins by actin dynamics and thrombospondin oligomer state. Biosci Rep. 35, (2015).
- Mumby, S. M., Abbott-Brown, D., Raugi, G. J., Bornstein, P. Regulation of thrombospondin secretion by cells in culture. J Cell Physiol. 120, 280-288 (1984).
- Myllyharju, J. Extracellular matrix and developing growth plate. Curr Osteoporos Rep. 12, 439-445 (2014).
- Roughley, P. J. Articular cartilage and changes in arthritis: noncollagenous proteins and proteoglycans in the extracellular matrix of cartilage. Arthritis Res. 3, 342-347 (2001).
- Naba, A., et al. The matrisome: in silico definition and in vivo characterization by proteomics of normal and tumor extracellular matrices. Mol Cell Proteomics. 11, M111 014647 (2012).
- Sanchez, P. L., et al. Acellular human heart matrix: A critical step toward whole heart grafts. Biomaterials. 61, 279-289 (2015).
