Une seule étape simple protocole Dissection pour Whole-mount Préparation des adultes<em> Drosophila</em> Brains
Summary
L'adulte drosophile cerveau est un système utile pour l' étude de circuits neuronaux, les fonctions supérieures du cerveau et des troubles complexes. Une méthode efficace pour disséquer tout le tissu du cerveau de la petite tête de mouche facilitera les études basées sur le cerveau. Nous décrivons ici une seule étape simple protocole, de la dissection des cerveaux adultes avec une morphologie bien préservée.
Abstract
Il y a un intérêt croissant pour l' utilisation de drosophile pour modéliser les maladies dégénératives cérébrales humaines, la carte circuitries neuronales dans le cerveau adulte, et d' étudier la base moléculaire et cellulaire des fonctions cérébrales supérieures. Une préparation toute monture de cerveaux adultes avec une morphologie bien conservée est critique pour de telles études sur la base du cerveau entières, mais peut être techniquement difficile et prend du temps. Ce protocole décrit une approche de dissection en une étape facile à apprendre, d'une tête de mouche adulte en moins de 10 s, tout en gardant le cerveau intact attaché au reste du corps pour faciliter les étapes de traitement ultérieures. La procédure permet de supprimer la plupart des tissus de l'oeil et trachéaux normalement associées au cerveau qui peut interférer avec l'étape de formation d'image ultérieure, et met également moins de demande sur la qualité de la pince à disséquer. En outre, nous décrivons une méthode simple qui permet le retournement commode des échantillons de cerveau montés sur une lamelle couvre-objet, ce qui est important pour imager les deux côtés du bpluies avec une intensité de signal similaire et de qualité. À titre d'exemple du protocole, nous présentons une analyse des dopaminergiques (DA) des neurones dans le cerveau adulte de WT (w 1118) mouches. L'efficacité élevée de la méthode de dissection, il est particulièrement utile pour des études basées sur le cerveau des adultes à grande échelle dans la drosophile.
Introduction
Le organisme modèle drosophile, communément connu comme la mouche des fruits, a longtemps été apprécié pour ses outils génétiques élégants, les temps de reproduction courtes et très conservée voies moléculaires et cellulaires. La mouche des fruits a été employée avec succès pour disséquer les voies de signalisation de base, les mécanismes de mise en forme d'organismes multicellulaires, ainsi que les mécanismes sous – jacents du développement neuronal, les fonctions et les maladies 1,2. Avec les récents progrès dans les technologies de marquage cellulaire et d' imagerie, le cerveau de la mouche des fruits est devenu particulièrement puissant dans la cartographie fine des circuits neuronaux et à disséquer la base moléculaire et cellulaire des fonctions cérébrales supérieures, telles que l' apprentissage et la mémoire, et le rythme circadien 1,3, 4,5,6,7,8.
Un avantage particulier du système Drosophila est sa taille relativement petite, ce qui permet toute monture préparation et l' examen du cerveau en utilisant un composé régulier ou microscope confocal. This fonctionnalité permet des analyses détaillées anatomiques et fonctionnelles des circuits neuronaux, ou même un seul neurone, au niveau cellulaire et subcellulaire, dans le contexte d'un tissu du cerveau entier, offrant ainsi à la fois une vision globale du sujet étudié et sa géométrie exacte dans l'ensemble cerveau. Cependant, étant donné la taille plutôt miniature du cerveau, il présente également un défi technique efficace de dissection d'un tissu cérébral intact sur le boîtier de protection de la tête d'exosquelette dans une mouche adulte. Diverses méthodes de dissection efficaces et relativement simples ont été décrites en détail, qui impliquent habituellement prudent et pas-sage retrait du boîtier de la tête et les tissus associés , y compris les yeux, de la trachée, et la graisse du cerveau proprement dit 9, 10 Ces méthodes de dissection. Microchirurgie placer souvent des exigences plutôt strictes sur la qualité de la pince de dissection, se fondant sur une pince avec de fines pointes bien alignées qui peuvent être facilement endommagés. En outre, comme les cerveaux disséqués sont souvent separated du reste du corps, le cerveau peuvent facilement être perdus au cours des processus de coloration et de lavage ultérieures en raison de leur petite taille et leur transparence dans la mémoire tampon de traitement. Ici, nous décrivons un protocole de dissection une étape relativement simple et facile à apprendre, pour les cerveaux adultes qui maintient les cerveaux disséqués attachés au torse. Le processus de dissection souvent efface facilement loin la plupart des tissus du cerveau associées telles que l'œil et de la trachée et réduit la demande pour les pinces de dissection de bonne qualité.
En outre, lorsque l'imagerie du cerveau au microscope composé fluorescent ou un microscope confocal, la partie du cerveau qui est éloigné de la source de lumière fluorescente produit souvent un signal plus faible et les images moins précises en raison de l'épaisseur du cerveau entier monture. Ici, nous décrivons également une méthode de montage simple qui permet de retournement facile des échantillons du cerveau, ce qui permet l'imagerie pratique des deux côtés du cerveau avec signal similaire intensity et de qualité.
Comme une preuve de concept pour l'application de cette méthode pour étudier le cerveau adulte, nous avons examiné en outre la présence de neurones dopaminergiques dans le cerveau des w 1118 mouches; un génotype qui est souvent utilisé comme la lignée parentale pour générer des mouches transgéniques et le contrôle de type sauvage dans de nombreuses études de drosophile.
Protocol
Representative Results
Discussion
Avec un intérêt croissant à l' aide de la drosophile adulte cerveau pour étudier les maladies humaines du cerveau, circuits neuronaux et les fonctions supérieures du cerveau, il est nécessaire de développer des méthodes simples et rapides pour obtenir les cerveaux des mouches intactes pour toute monture d' analyses, ce qui est particulièrement important pour les Large- l'échelle des écrans à base de cerveau. Notre méthode fournit un moyen simple et facile à apprendre approche de dissé…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons M. Enes Mehmet, Mme Kiara Andrade, Mme Pilar Rodriguez, Chris Kwok, et Mme Danna Ghafir pour leur immense soutien au projet.
Materials
| w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51652 | Balancer was switched to TM6B |
| PBac{WH}parkf01950 | Exelixis at Harvard Medical School | f01950 | Balancer was switched to TM6C |
| NaCl | Fisher Scientific | S640-500 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-003-990 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-004-198 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | 02-003-265 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | Replaces glucose |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22µ Pore Size | Fisher Scientific | GVWP14250 | |
| Formalin Solution, 10% (Histological) | Fisher Scientific | SF98-20 | |
| Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent | Fisher Scientific | 02-003-823 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points | Fisher Scientific | 17-456-055 | Protocol does not require very fine points. |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Pel-Freez Biologicals | P40101 | |
| Rat-Elav-7E8A10 anti-elav | The Developmental Studies Hybridoma Bank | Clone 7E8A10 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21247 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11037 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Propyl gallate powder | Sigma-Aldrich | P3130-100G | |
| Glycerol ACS reagent, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | G7893-500ML | |
| Zeiss Axioimager Z1 | Zeiss | Quote | |
| Zeiss Apotome.2 | Zeiss | Quote | |
| Zen lite software | Quote |
References
- Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit flies in biomedical research. Genetics. 199, 639-653 (2015).
- Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan’s legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163, 12-14 (2015).
- Aso, Y., et al. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, 04577 (2014).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Res. 11, 1114-1125 (2001).
- Yamagata, N., et al. Distinct dopamine neurons mediate reward signals for short- and long-term memories. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 578-583 (2015).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 2967-2976 (2015).
- Waddell, S. Neural Plasticity: Dopamine Tunes the Mushroom Body Output Network. Curr Biol. 26, 109-112 (2016).
- Wolff, T., Iyer, N. A., Rubin, G. M. Neuroarchitecture and neuroanatomy of the Drosophila central complex: A GAL4-based dissection of protocerebral bridge neurons and circuits. J Comp Neurol. 523, 997-1037 (2015).
- Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 1472-1474 (2011).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1, 2110-2115 (2006).
- Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).
- White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila. Front Neurosci. 4, 205 (2010).
- Yang, Y., et al. Mitochondrial pathology and muscle and dopaminergic neuron degeneration caused by inactivation of Drosophila Pink1 is rescued by Parkin. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 10793-10798 (2006).
- Greene, J. C., et al. Mitochondrial pathology and apoptotic muscle degeneration in Drosophila parkin mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4078-4083 (2003).
- Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8024-8029 (2005).
- Pesah, Y., et al. Drosophila parkin mutants have decreased mass and cell size and increased sensitivity to oxygen radical stress. Development. 131, 2183-2194 (2004).
- Trinh, K., et al. Decaffeinated coffee and nicotine-free tobacco provide neuroprotection in Drosophila models of Parkinson’s disease through an NRF2-dependent mechanism. J Neurosci. 30, 5525-5532 (2010).
- Kim, K., Kim, S. H., Kim, J., Kim, H., Yim, J. Glutathione s-transferase omega 1 activity is sufficient to suppress neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson disease. J Biol Chem. 287, 6628-6641 (2012).
