간단한 한 단계 성인의 전체 마운트 준비에 대한 해부 프로토콜<em> 초파리</em> 두뇌
Summary
성인 초파리 뇌는 신경 회로, 높은 뇌 기능, 복잡한 질환 연구를위한 유용한 시스템이다. 효율적인 방법은 뇌 기반 연구를 용이하게 작은 비행 머리에서 전체 뇌 조직을 해부한다. 여기에 우리가 잘 보존 된 형태와 성인 두뇌의 간단한 한 단계 해부 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
인간의 뇌 퇴행성 질환 모델 성인 뇌에서 신경 회로들을 매핑하고, 높은 뇌 기능의 분자 및 세포 기초 공부 초파리 사용에 관심이 증대되고있다. 잘 보존 된 형태와 성인 두뇌의 전체 마운트 준비는 전체 뇌 기반 연구를위한 중요하지만, 기술적으로 어렵고 시간이 많이 소요 될 수 있습니다. 이후의 처리 단계를 용이하게하기 위해 본체의 나머지에 부착 된 그대로의 뇌를 유지하면서,이 프로토콜은, 이하 10 초에서 성인 플라이 머리 쉬운-내용 원스텝 절개 방법을 설명한다. 이 절차는 일반적으로 나중에 묘화 공정을 방해 할 수있는 뇌와 관련된 눈 기관 조직의 대부분을 제거하는 것을 돕고, 또한 해부 포셉의 품질에 덜 요구 놓는다. 또한, 우리는 (B)의 양쪽을 이미징 중요 커버 슬립에 장착 뇌 샘플의 편리 반전을 가능하게하는 간단한 방법을 설명비슷한 신호 강도 및 품질 비. 프로토콜의 예로서, 우리는 WT 성인 뇌에서 도파민 (DA) 신경 세포의 분석을 제시한다 (1,118와트) 날아간다. 절개 방법의 높은 효능은 초파리에서 대규모 성인 뇌 기반 연구에 특히 유용합니다.
Introduction
일반적으로 과일 파리로 알려진 모델 생물 초파리는 긴 우아한 유전 도구, 짧은 생식 번 평가하고, 높은 분자 및 세포 경로를 보존하고있다. 초파리 성공적 기본 신호 경로 다세포 유기체의 패터닝 메커니즘뿐만 아니라, 신경 발달 기능의 기초가되는 메커니즘 질병 1,2- 해부하는데 이용되어왔다. 셀 라벨 및 이미징 기술의 최근 발전과 함께, 초파리의 뇌는 신경 회로의 미세 매핑 및 학습과 기억, 그리고 활동 일주기 1,3와 같은 높은 뇌 기능의 분자 및 세포 기초를 해부 특히 강력한되고있다 4,5,6,7,8.
초파리 시스템의 하나의 특별한 장점은 일정한 화합물 또는 공 초점 레이저 주사 현미경을 이용하여 전체 뇌 실장 준비 및 시험 수는 상대적으로 작은 크기이다. 티S 기능 따라서 전체 내에서 연구 된 환자의 전체적인 관점 그 정확한 형상을 모두 제공하는 전체 뇌 조직의 맥락에서, 세포 및 세포 내 수준의 신경 회로의 상세한 해부학 및 기능 분석 또는 단일 뉴런을 활성화 뇌. 그러나, 뇌의 미니어처 크기보다는 주어진 또한 효율적 성인 플라이에 보호 외골격 헤드 케이스로부터 온전한 뇌 조직 해부의 기술적 과제를 제시한다. 다양한 효과적이고 상대적으로 단순한 박리 방법은 일반적주의 포함하고 단계적 헤드 케이스를 제거하고 눈을 포함한 관련 조직, 기관, 지방을 9,10. 이러한 미세 수술 절개 방법 적절한 뇌로부터의 상세히 설명되었지만 자주 쉽게 손상 될 수있는 미세 잘 정렬 된 팁 집게에 의존 해부 포셉의 품질에 다소 엄격한 요구를 배치합니다. 또한, 같은 해부 뇌는 종종 해부하다신체의 나머지 에드 뇌 쉽게 그들의 작은 크기 및 프로세싱 버퍼 투명성의 연속 염색 및 세척 과정 중에 손실 될 수있다. 여기, 우리는 몸통에 부착 된 해부 두뇌를 유지 성인의 뇌에 대한 비교적 간단하고 배우기 쉬운 한 단계 해부 프로토콜을 설명합니다. 해부 과정은 종종 쉽게 눈과기도로 뇌 관련 조직의 대부분을 멀리 지우고 좋은 품질의 해부 포셉에 대한 수요를 감소시킨다.
형광 화합물 현미경 또는 공 초점 현미경으로 뇌를 영상화 할 때 또한, 멀리 형광 광원으로부터 뇌의 측면은 종종 인해 전체 마운트 뇌의 두께로 약한 신호와 적은 선명한 이미지를 생성합니다. 여기서는 유사한 신호 intensi와 뇌의 양측의 편리한 촬상있게 뇌 샘플 쉽게 반전을 허용하는 간단한 장착 방법을 서술타이 및 품질.
개념 증명 성인의 뇌를 연구하는이 방법의 응용 프로그램에 대한, 우리는 또한 1118 파리 w의 뇌에서 DA 뉴런의 존재를 조사; 종종 유전자 파리 많은 초파리 연구 야생형 제어를 생성하기위한 부모 선으로 사용되는 유전자형.
Protocol
Representative Results
Discussion
인간의 뇌 질환, 신경 회로, 및 높은 뇌 기능을 연구하기 위해 성인 초파리 뇌 사용에 대한 관심이 증가, 대형 – 특히 중요 전체 마운트 분석을위한 완전한 비행 뇌를 얻었다 간단하고 빠른 방법을 개발하는 것이 필요하다 뇌 기반의 화면을 확장 할 수 있습니다. 우리의 방법은 간단하고 배우기 쉬운 플라이 머리를 해부하는 방법을 (자주 경험 미만 10 초에) 잘 보존 된 형태와 크게 관련 조직?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 프로젝트에 자신의 엄청난 지원 씨 ENES 메 흐멧, 미스 키아라 엔드 레데, 미스 필로드 리 게스, 크리스 곽, 그리고 양 다나 Ghafir을 인정합니다.
Materials
| w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51652 | Balancer was switched to TM6B |
| PBac{WH}parkf01950 | Exelixis at Harvard Medical School | f01950 | Balancer was switched to TM6C |
| NaCl | Fisher Scientific | S640-500 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-003-990 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-004-198 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | 02-003-265 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | Replaces glucose |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22µ Pore Size | Fisher Scientific | GVWP14250 | |
| Formalin Solution, 10% (Histological) | Fisher Scientific | SF98-20 | |
| Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent | Fisher Scientific | 02-003-823 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points | Fisher Scientific | 17-456-055 | Protocol does not require very fine points. |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Pel-Freez Biologicals | P40101 | |
| Rat-Elav-7E8A10 anti-elav | The Developmental Studies Hybridoma Bank | Clone 7E8A10 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21247 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11037 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Propyl gallate powder | Sigma-Aldrich | P3130-100G | |
| Glycerol ACS reagent, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | G7893-500ML | |
| Zeiss Axioimager Z1 | Zeiss | Quote | |
| Zeiss Apotome.2 | Zeiss | Quote | |
| Zen lite software | Quote |
References
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