Der erwachsene Drosophila Gehirn ist ein wertvolles System zur Untersuchung der neuronalen Schaltkreise, höhere Hirnfunktionen und komplexe Erkrankungen. Eine effiziente Methode ganze Hirngewebe von der kleinen Fliegenkopf zu sezieren werden Gehirn basierte Studien erleichtern. Hier beschreiben wir eine einfache, one-step-Dissektion Protokoll von erwachsenen Gehirn mit gut erhaltenen Morphologie.
Es gibt ein zunehmendes Interesse Drosophila im Umgang mit menschlichen Gehirn degenerative Krankheiten zu modellieren, neuronale Schaltkreise in erwachsenen Gehirn abbilden und untersuchen die molekularen und zellulären Grundlagen der höheren Hirnfunktionen. Eine ganze Montage Vorbereitung von erwachsenen Gehirn mit gut erhaltenen Morphologie ist von entscheidender Bedeutung für eine solche ganze Gehirn-basierte Studien, kann aber technisch anspruchsvoll und zeitaufwendig sein. Dieses Protokoll beschreibt eine einfach zu erlernende, Ein-Schritt-Dissektion Ansatz eines erwachsenen Fliege Kopf in weniger als 10 s, während das intakte Gehirn zum Rest des Körpers angebracht halten nachfolgende Bearbeitungsschritte zu erleichtern. Das Verfahren hilft die meisten der Augen- und tracheale Gewebe entfernen, die normalerweise mit dem Gehirn verbunden, die mit dem späteren Abbildungsschritt stören kann, und stellt auch weniger Anforderungen an die Qualität der Pinzette. Zusätzlich beschreiben wir eine einfache Methode, die auf einem Deckglas praktisch Umklappen der montierten Gehirnproben ermöglicht, die zum Abbilden auf beiden Seiten der b wichtig istRegen mit ähnlichen Signalstärke und Qualität. Als ein Beispiel des Protokolls, wir eine Analyse der dopaminerge (DA) Neuronen in Gehirnen von erwachsenen WT präsentieren (w 1118) fliegt. Die hohe Wirksamkeit der Dissektion Methode macht es besonders nützlich für große erwachsenen Gehirn-basierte Studien in Drosophila.
Der Modellorganismus Drosophila, die gemeinhin als die Fruchtfliege bekannt ist , hat für seine eleganten genetischen Werkzeuge, kurze Fortpflanzungszeiten, geschätzt und hoch konservierten molekularen und zellulären Wege lang sind. Die Fruchtfliege wurde erfolgreich eingesetzt grundlegende Signalwege zu sezieren, die Strukturierungsmechanismen von mehrzelligen Organismen, sowie die Mechanismen der neuronalen Entwicklung, Funktionen zugrunde liegen, und Krankheiten 1,2. Mit den jüngsten Fortschritten in Zellmarkierung und Imaging – Technologien, hat die Fruchtfliege Gehirn besonders mächtig geworden in Feinkartierung der neuronalen Schaltkreise und in der molekularen und zellulären Grundlagen der höheren Hirnfunktionen zu sezieren, wie Lernen und Gedächtnis, und zirkadianen Rhythmus 1,3, 4,5,6,7,8.
Ein besonderer Vorteil des Drosophila – Systems ist seine relativ kleine Größe, so dass ganze Montage Vorbereitung und Untersuchung des Gehirns eine regelmäßige Verbindung oder konfokalen Mikroskop. This-Funktion ermöglicht eine detaillierte anatomische und funktionelle Analysen der neuronalen Schaltkreise, oder auch nur ein einziges Neuron, auf zellulärer und subzellulärer Ebene im Rahmen einer ganzen Hirngewebe, so dass sowohl eine ganzheitliche Sicht des untersuchten Subjekts und seiner exakten Geometrie innerhalb der gesamten Bereitstellung Gehirn. Doch die eher geringen Größe des Gehirns gegeben, es stellt auch eine technische Herausforderung bei der effizienten ein intaktes Hirngewebe aus dem Schutz Exoskelett Kopf Fall bei einem erwachsenen Fliege sezieren. Verschiedene wirksame und relativ einfache Dissektion Methoden wurden im Detail beschrieben , die in der Regel vorsichtig beinhalten und stufenweise Entfernung des Kopfgehäuses und die damit verbundenen Gewebe , einschließlich der Augen, der Trachea und Fett aus dem Gehirn richtigen 9, 10. Diese mikrochirurgische Dissektion Methoden oft legen eher hohe Anforderungen an die Qualität der Präparation einer Pinzette, mit feinen gut ausgerichteten Spitzen auf einer Pinzette verlassen, die leicht beschädigt werden können. Außerdem ist, wie die Gehirne seziert sind oft separatwegen ihrer geringen Größe und ihrer Transparenz im Verarbeitungspuffer ed von dem Rest des Körpers, kann die Gehirne leicht während der nachfolgenden Färbung und Waschverfahren verloren. Hier beschreiben wir eine relativ einfache und leicht zu erlernende, Ein-Schritt-Dissektion Protokoll für die erwachsenen Gehirn, die die seziert Gehirne an dem Rumpf hält. Die Dissektion Prozess löscht oft leicht die meisten der Gehirn-assoziierten Gewebe wie das Auge und die Luftröhre entfernt und verringert die Nachfrage nach guter Qualität Dissektion Pinzette.
Zusätzlich wird, wenn das Gehirn unter dem Fluoreszenzmikroskop Verbindung oder konfokalen Mikroskop Bildgebung, die Seite des Gehirns, die von der fluoreszierenden Lichtquelle weg erzeugt oft ein schwächeres Signal und weniger klare Bilder aufgrund der Dicke des gesamten Montage Gehirn. Hier haben wir auch eine einfache Montage-Methode beschreiben, die leicht Umklappen der Gehirnproben ermöglicht, so dass bequem Bildgebung von beiden Seiten des Gehirns mit ähnlichen Signal intensiviertenty und Qualität.
Als proof-of-concept für die Anwendung dieses Verfahrens das adulte Gehirn zu untersuchen, untersuchten wir ferner die Anwesenheit von DA – Neuronen im Gehirn von w 1118 Fliegen; ein Genotyp , die oft als die Elternlinie verwendet wird transgenen Fliegen und die Wildtyp – Kontrolle in vielen Drosophila Studien zu erzeugen.
Mit zunehmendem Interesse an der Verwendung erwachsenen Drosophila Gehirn menschliche Gehirn Krankheiten zu studieren, neuronale Schaltkreise und höheren Hirnfunktionen, ist es notwendig , eine einfache und schnelle Methoden zu entwickeln , intakte Fliegen Gehirne für ganze-mount zu erhalten Analysen, die für groß besonders wichtig ist , skalieren Gehirn-basierte Bildschirme. Unser Verfahren bietet eine einfache und leicht zu erlernende Ansatz eine Fliege Kopf zu sezieren aus (oft in weniger als 10 s mit Er…
The authors have nothing to disclose.
Wir erkennen an Mr. Enes Mehmet, Frau Kiara Andrade, Frau Pilar Rodriguez, Chris Kwok und Frau Danna Ghafir für ihre immense Unterstützung für das Projekt.
w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51652 | Balancer was switched to TM6B |
PBac{WH}parkf01950 | Exelixis at Harvard Medical School | f01950 | Balancer was switched to TM6C |
NaCl | Fisher Scientific | S640-500 | |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-003-990 | |
Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-004-198 | |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | 02-003-265 | |
D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | Replaces glucose |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22µ Pore Size | Fisher Scientific | GVWP14250 | |
Formalin Solution, 10% (Histological) | Fisher Scientific | SF98-20 | |
Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent | Fisher Scientific | 02-003-823 | |
Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points | Fisher Scientific | 17-456-055 | Protocol does not require very fine points. |
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Pel-Freez Biologicals | P40101 | |
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav | The Developmental Studies Hybridoma Bank | Clone 7E8A10 | |
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21247 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11037 | |
DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
Propyl gallate powder | Sigma-Aldrich | P3130-100G | |
Glycerol ACS reagent, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | G7893-500ML | |
Zeiss Axioimager Z1 | Zeiss | Quote | |
Zeiss Apotome.2 | Zeiss | Quote | |
Zen lite software | Quote |