המוח תסיסנית הבוגרת הוא מערכת יקרה ללימוד מעגלים עצביים, תפקוד מוח גבוה, והפרעות מורכבות. שיטה יעילה כדי לנתח רקמות מוח כולו מראש הזבוב הקטן תקל מחקרים מבוססי מוח. כאן אנו מתארים פשוט, פרוטוקול לנתיחת צעד אחד של מוחות בוגרים עם מורפולוגיה השתמרה היטב.
יש עניין גובר בשימוש תסיסנית מודל מחלות ניווניות במוח האנושי, למפות circuitries עצביים במוח הבוגר, וללמוד את הבסיס המולקולרי הסלולר של תפקודי מוח גבוהים. תכשיר כל ההר של מוחות בוגרים עם מורפולוגיה השתמרה היטב הוא קריטי ללימודי מוח מבוסס כולו כזה, אבל יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית ונדרש זמן רב. פרוטוקול זה מתאר גישת דיסקציה קלה ללמוד, צעד אחד של ראש זבוב בוגר תוך פחות מ -10 שניות, תוך שמירה במוח השלם מחובר לשאר הגוף כדי להקל מדרגות עיבוד שלאחר מכן. ההליך מסייע להסיר ביותר של רקמות העין לקנה הנשימה הקשורים בדרך כלל עם המוח שיכולים להפריע צעד הדמיה מאוחר יותר, וגם מציב פחות ביקוש על איכות מלקחיים לנתח. בנוסף, אנו מתארים שיטה פשוטה המאפשרת מרפרף נוח של דגימות מוח רכוב על coverslip, שהינה חשובה הדמיה משני צידי בגשמים בעצמה ואיכות אות דומות. כדוגמה של הפרוטוקול, אנו מציגים ניתוח של דופאמין (DA) נוירונים במוח הבוגר של WT (w 1118) זבובים. היעילות הגבוהה של השיטה לנתיחה עושה את זה שימושי במיוחד עבור מבוגר בקנה מידה גדולה מחקרי מוח מבוססים תסיסנית.
האורגניזם המודל תסיסנית, הידוע בכינויו זבוב הפרות, כבר מוערך ארוך עבור הכלים הגנטיים האלגנטיים שלה, פעמי רבייה קצרות, ומאוד נשמר מסלולים מולקולריים תאיים. זבוב הפרות הועסק בהצלחה לנתח מסלולי איתות בסיסיים, מנגנוני הדפוסים של יצורים רבים-תאיים, כמו גם את מנגנוני התפתחות עצבית, פונקציות, ומחלות 1,2. עם התקדמות בטכנולוגיות תיוג הדמית תא, מוח זבוב פרות הפך חזק במיוחד במיפוי קנס של מעגלים עצביים לשלוף את הבסיס המולקולרי הסלולר של תפקודי מוח גבוהים, כגון למידה וזיכרון, וכן מקצב צירקדי 1,3, 4,5,6,7,8.
יתרון אחד מסוים של מערכת תסיסנית הוא גודלו הקטן יחסית, מה שמאפשר כל הר הכנה ובדיקה של המוח באמצעות תרכובת רגילה או מיקרוסקופ confocal. תיתכונה של אפשר ניתוחים אנטומיים מפורטים ופונקציונליים של מעגלים עצביים, או אפילו תא עצב יחיד, ברמות הסלולר subcellular, בהקשר של רקמות מוח כולו, ובכך לספק היא נקודת מבט הוליסטית של המטפלים בנושא והגיאומטריה המדויקת שלה בתוך המכלול מוֹחַ. עם זאת, בהתחשב בגודל מיניאטורי למדי של המוח, זה גם אתגר טכני לנתח רקמה במוח שלמה ביעילות מתוך תיק ראש השלד חיצוני המגן בתוך זבוב בוגר. יעיל שונה ופשוט יחסית שיטות לנתיחה תוארו בפירוט, אשר בדרך כלל כרוכות זהיר צעד חכם הסרה במקרה הראש ואת הרקמות הקשורות כוללות העיניים, קנה נשימה, שומן מהמוח 9 הראוי, 10. שיטות לנתיחת מייקרו אלה לעתים קרובות למקום יותר בדרישות המחמירות על איכות מלקחיים לנתיחה, בהסתמך על מלקחיים עם עצות גם מזדהות בסדר כי עלולים להיפגע בקלות. יתרה מזאת, כפי המוח הגזור הוא בדרך כלל בהסרהאד משאר הגוף, המוח יכול בקלות ללכת לאיבוד במהלך תהליכי המכתים והשטיפה עוקבים כי בעלי המידות הקטנות שלהם והשקיפות שלהם למאגר העיבוד. כאן, אנו מתארים פשוט יחסית וקל ללמוד, פרוטוקול לנתיחת צעד אחד עבור מוחות בוגרים שמחזיקים את המוח הגזור מצורף הטורסו. תהליך לנתיחה לעתים קרובות בקלות מנקה את רוב הרקמות הקשורים במוח כגון העין ואת קנה הנשימה ומקטין את הביקוש מלקחיים דיסקציה באיכות טובה.
בנוסף, כאשר הדמית המוח מתחת למיקרוסקופ מתחם הניאון או confocal, הצד של המוח כי הוא הרחק ממקור אור פלורסנט לעתים קרובות מייצר אות חלשה ותמונות פחות ברורות בשל העובי של המוח כל ההר. כאן אנו גם מתארים שיטת הרכבה פשוטה המאפשרת מרפרף קל של דגימות המוח, המאפשר הדמיה נוחה של שני הצדדים של המוח עם intensi אות הדומהty ואיכות.
כהוכחה של קונספט עבור היישום של השיטה בחקר המוח הבוגר, עוד בחנו את הנוכחות של נוירונים DA במוחם של w 1118 זבובים; גנוטיפ זה משמש לעתים קרובות כקו ההורי להפקת זבובים מהונדסים ואת שליטת wildtype במחקרים תסיסנית רבים.
עם עניין גובר בשימוש מוח תסיסנית מבוגר כדי לחקור מחלות מוח אנושיות, מעגלים עצביים, ועל תפקוד מוח גבוה, יש צורך לפתח שיטות פשוטות ומהירות להשיג מוח זבוב על תילן כל הר מנתח, אשר חשוב במיוחד עבור מידה גדולה סולם מסך מוחי. השיטה שלנו מספקת פשוט וקל ללמוד גישה לנתח את ר?…
The authors have nothing to disclose.
אנו מכירים מר Enes מחמט, הגב 'קיארה אנדרדה, הגב' פילאר רודריגז, כריס קווק, והגב 'דנה Ghafir לתמיכה העצומה שלהם לפרויקט.
w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51652 | Balancer was switched to TM6B |
PBac{WH}parkf01950 | Exelixis at Harvard Medical School | f01950 | Balancer was switched to TM6C |
NaCl | Fisher Scientific | S640-500 | |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-003-990 | |
Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-004-198 | |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | 02-003-265 | |
D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | Replaces glucose |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22µ Pore Size | Fisher Scientific | GVWP14250 | |
Formalin Solution, 10% (Histological) | Fisher Scientific | SF98-20 | |
Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent | Fisher Scientific | 02-003-823 | |
Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points | Fisher Scientific | 17-456-055 | Protocol does not require very fine points. |
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Pel-Freez Biologicals | P40101 | |
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav | The Developmental Studies Hybridoma Bank | Clone 7E8A10 | |
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21247 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11037 | |
DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
Propyl gallate powder | Sigma-Aldrich | P3130-100G | |
Glycerol ACS reagent, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | G7893-500ML | |
Zeiss Axioimager Z1 | Zeiss | Quote | |
Zeiss Apotome.2 | Zeiss | Quote | |
Zen lite software | Quote |