Summary

إعداد شرائح أفقية من الكبار شبكية العين الفأر للدراسات الكهربية

Published: January 27, 2017
doi:

Summary

وضعنا إعداد شريحة الأفقي للشبكية العين الكبار الثدييات مع الطائرة من باجتزاء موازية لسطح الشبكية. لم اقتطاع الحقول الجذعية من الخلايا العصبية للشبكية موجهة nonradially، والسماح للدراسة معالجة الإشارات مع تقنيات التصحيح، المشبك والتصوير.

Abstract

يتم وضع الاستعدادات شريحة رأسية أيضا لدراسة الدوائر ونقل الإشارات في الكبار شبكية الثدييات. الطائرة من باجتزاء في هذه الاستعدادات هي عمودي على سطح الشبكية، مما يجعلها مثالية لدراسة الخلايا العصبية الموجهة شعاعيا مثل خلايا مستقبلة للضوء والخلايا القطبين. ومع ذلك، فإن العرش شجيري كبيرة من الخلايا الأفقية، وخلايا عديم الاستطالات واسعة المجال، وخلايا العقدة هي في معظمها مبتورة، وترك انخفضت بشكل ملحوظ النشاط متشابك في هذه الخلايا. في حين أن خلايا العقدة والخلايا عديم الاستطالات المشردين يمكن دراستها في إعداد كله محمولة على شبكية العين، والخلايا الأفقية والخلايا عديم الاستطالات تقع في الطبقة النووية الداخلية يمكن الوصول إليها لأقطاب في أنسجة شبكية العين كلها سيئة فقط.

لتحقيق أقصى قدر من سهولة الوصول وسلامة متشابك، وضعنا إعداد شريحة الأفقي للشبكية العين الماوس، ودرس نقل الإشارات في المشبك بين خلايا مستقبلة للضوء والأفقيالخلايا. باجتزاء الأفقي يسمح (1) التعرف البصري سهلة واضح لا لبس فيه من أجسام الخلايا الأفقية لاستهداف الكهربائي، و (2) الحفاظ على حقول شجيري الخلايا الأفقية الممتدة، كشرط أساسي لحالها وظيفية مخروط مدخلات متشابك إلى التشعبات الخلية الأفقية.

الخلايا الأفقية من شرائح أفقية أظهرت النشاط متشابك منشط في الظلام، وأنها استجابت لإطلاع ومضات من الضوء مع الحد من الداخل النشاط متشابك الحالي وتقلص. تشير الأدلة Immunocytochemical أن ما يقرب من جميع المخاريط في مجال شجيري خلية الأفقية تضع نقاط الاشتباك العصبي مع التشعبات في الطرفية. لذلك مناسبة لإعداد شريحة الأفقي كذلك دراسة الخصائص الفسيولوجية للالخلايا العصبية للشبكية ممتدة أفقيا وكذلك نقل الإشارات الحسية والتكامل بين نقاط الاشتباك العصبي المحدد.

Introduction

يتم ترميز المعلومات البصرية كنمط الديناميكي المكانية والزمانية لتفعيل مبصرة، والمشبك الشريط بين خلايا مستقبلة للضوء والخلايا العصبية من الدرجة الثانية قرر نقل المصب من المعلومات البصرية. إعداد شريحة الرأسي للشبكية الثدييات هو أداة قيمة للغاية لدراسة معالجة الإشارات في مسارات العمودي، أي بين خلايا مستقبلة للضوء والخلايا القطبين، وبين خلايا ثنائية القطب وبعض أنواع الخلايا عديم الاستطالات 4.

ومع ذلك، باجتزاء الرأسي يسبب دائما اقتطاع شديد في مجالات شجيري من العديد من الخلايا العصبية للشبكية، مما أدى إلى خسائر كبيرة في الاتصالات متشابك. خاصة في شبكية العين الخارجية، وتتأثر خلايا الأفقية بسبب حقول ممتدة تنتشر أفقيا على شجيري والنظم محطة محور عصبي 5. في رأسيوبالتالي انخفاض إعداد شريحة، ومدخلات متشابك من مئات المحطات مخروط مبصرة لالتشعبات خلية الأفقية على عدد قليل من الاتصالات متفرق. وهذا قد يكون كافيا لدراسة خصائص نقاط الاشتباك العصبي الفردية، ولكنها لا تمثل بأي حال من الأحوال قدرات معالجة الإشارات الكامنة وراء تفعيل متزامنة من نقاط الاشتباك العصبي مبصرة الشريط.

لذا قمنا بتطوير إعداد شريحة الأفقي، مما يترك ما يقرب من جميع مبصرة مخروط مدخلات متشابك إلى التشعبات الخلية الأفقية سليمة وظيفية. الطائرة من يدير باجتزاء موازية لسطح شبكية العين، وقطع مثالي من خلال طبقة النووية الداخلية بين الخلايا الأفقية والخلايا عديم الاستطالات. وهكذا، شرائح أفقية من شبكية العين الخارجي يتم إنشاؤها تحتوي، على الموقع قبل المشبكي، المستقبلات الضوئية مع قطاعات الداخلية والخارجية وكذلك محطات متشابك، والخلايا الأفقية وخلايا القطبين على الموقع بعد المشبكي. هذا المستحضر يناسب جيدا رس التحقيق مدخلات متشابك منسقة في التشعبات الخلية الأفقية جميع مبصرات مخروط داخل مجالها شجيري. ومن ثم قد تكون مفيدة لفهم أفضل للعمل من المشبك مستقبلة للضوء الشريط، وهو أمر حاسم لنقل المعلومات البصرية من المصفوفة تفعيل مستقبلة للضوء في استجابة بعد المشبكي.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية لالتجارب على الحيوانات الصادرة عن جمهورية ألمانيا الاتحادية. ملاحظة: نظرا لأن أنسجة الشبكية ستكون خالية من الأكسجين خلال أجزاء طويلة من هذا الإجراء، وينبغي إجراء جميع الخطوات من ف?…

Representative Results

في شرائح أفقية من شبكية العين الماوس، يمكن تحديد أجسام الخلايا الأفقية بسهولة وفقا لالتشكل فريدة من نوعها مع العديد من التشعبات الأولية الناشئة من المضلع خلايا الجسم (الشكل 1A). وكانت أجسام الخلايا الأفقية الموجودة بالقرب من سطح شريحة ي?…

Discussion

وعلى النقيض من شرائح عمودية، مورفولوجيا شجيري من الخلايا العصبية الموجهة شعاعيا مثل الخلايا الأفقية وخلايا عديم الاستطالات والحفاظ عليها جيدا. مقارنة الاستعدادات شبكية العين بأكملها، هذين النوعين من الخلايا يمكن الوصول إليها بسهولة لالميكروية ويمكن دراستها م?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG FOR701 and FE464/11-1 to A.F. The authors want to acknowledge the excellent technical assistance of Andrea Nerz.

Materials

Ames' Medium Sigma A1420
Sodium Bicarbonate Sigma S5761
Hepes Sigma H3375
Carbogen Air Liquide
Agarose Sigma A9045
35-mm petri dish (plastic) Nunc Thermofisher 150318
Glass petri dish Chemoline 50-1470-40
Isoflurane Dispensary university hospital
Vibratome injector blade Biosystems 39053250
Vibratome Leica Microsystems VT1200
Vibrocheck Leica Microsystems
Microwave
Water bath
Forceps
20-gauge needles
Spring scissors
Curved scalpel blades
Stereo microscope
Plastic Pasteur pipette
Glass Pasteur pipette

References

  1. DeVries, S. H., Li, W., Saszik, S. Parallel processing in two transmitter microenvironments at the cone photoreceptor synapse. Neuron. 50, 735-748 (2006).
  2. Jackman, S. L., et al. Role of the synaptic ribbon in transmitting the cone light response. Nature Neuroscience. 12 (3), 303-310 (2009).
  3. Rabl, K., Cadetti, L., Thoreson, W. B. Kinetics of exocytosis is faster in cones than in rods. J. Neurosci. 25 (18), 4633-4640 (2005).
  4. Singer, J. H., Lassová, L., Vardi, N., Diamond, J. S. Coordinated multivesicular release at a mammalian ribbon synapse. Nature Neuroscience. 7 (8), 826-833 (2004).
  5. Peichl, L., González-Soriano, J. Morphological types of horizontal cell in rodent retinae: a comparison of rat, mouse, gerbil, and guinea pig. Vis. Neurosci. 11, 501-517 (1994).
  6. Ames, A., Nesbett, F. B. In vitro retina as an experimental model of the central nervous system. J. Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).
  7. Mathis, D. M., Furman, J. J., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J. Vis. Exp. (49), (2011).
  8. Peichl, L., Sandmann, D., Boycott, B. B. Comparative anatomy and function of mammalian horizontal cells. Development of the Retina. , (1998).
  9. Feigenspan, A., Babai, N. Functional properties of spontaneous excitatory currents and encoding of light/dark transitions in horizontal cells of the mouse retina. Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2615-2632 (2015).
  10. Enoki, R., Jakobs, T. C., Koizumi, A. Horizontal slice preparation of the retina. J. Vis. Exp. (1), e108 (2006).
  11. Babai, N., et al. Functional roles of complexin3 and complexin4 at mouse photoreceptor ribbon synapses. J. Neurosci. 36, 6651-6667 (2016).
  12. Thoreson, W. B. Horizontal slices of mouse retina expose horizontal cells and their properties (Commentary on Feigenspan & Babai). Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2613-2614 (2015).

Play Video

Cite This Article
Feigenspan, A., Babai, N. Z. Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies. J. Vis. Exp. (119), e55173, doi:10.3791/55173 (2017).

View Video