Voorbereiding van de Horizontale Schijfjes van Adult Mouse Retina voor elektrofysiologisch onderzoek
Summary
We ontwikkelden een horizontale slice voorbereiding van de zoogdierretina volwassene met het vlak van snijden parallel aan het netvliesoppervlak. Dendritische gebied van nonradially georiënteerde retinale neuronen werden niet afgekapt, waardoor de studie van de signaalverwerking met patch-klem en beeldvormende technieken.
Abstract
Verticale slice voorbereidingen zijn goed ingeburgerd om circuits en signaaloverdracht studeren in de zoogdieren netvlies volwassene. Het vlak van snijden in deze preparaten loodrecht op het netvliesoppervlak, ideaal voor het bestuderen van radiaal georiënteerde neuronen zoals fotoreceptoren en bipolaire cellen. De grote dendritische assen van horizontale cellen, wide-field amacrine cellen en ganglioncellen meestal afgekapt, waardoor duidelijk verminderde synaptische activiteit in deze cellen. Dat ganglioncellen en verplaatste amacrine cellen kunnen worden onderzocht in een geheel gemonteerde opstelling van het netvlies, horizontale cellen en amacrine cellen in de binnenste kernlaag zijn alleen moeilijk toegankelijke voor elektroden geheel netvliesweefsel.
Om maximale toegankelijkheid en synaptische integriteit te bereiken, ontwikkelden we een horizontale slice voorbereiding van de muis netvlies, en studeerde signaaloverdracht bij de synaps tussen fotoreceptoren en horizontalecellen. Horizontale snijden maakt (1) eenvoudig en eenduidig visuele identificatie van de horizontale cellichamen voor elektrode targeting, en (2) het behoud van de uitgebreide horizontale cel dendritische velden, als een voorwaarde voor intacte en functionele kegel synaptische input voor horizontale cel dendrieten.
Horizontale cellen van horizontaal plakjes vertoonden tonic synaptische activiteit in het donker, en ze reageerden op lichtflitsen kort met een vermindering van de innerlijke huidige en verminderde synaptische activiteit. Immunocytochemische bewijsmateriaal wijst erop dat bijna alle kegels binnen de dendritische veld van een horizontale cel vast te stellen synapsen met zijn perifere dendrieten. De horizontale slice voorbereiding is derhalve geschikt voor de fysiologische eigenschappen horizontaal verlengde retinale neuronen en sensorische signaaloverdracht en integratie in geselecteerde synapsen te bestuderen.
Introduction
Visuele informatie wordt gecodeerd als een dynamische ruimte-tijd patroon van afdrukband activering, en het lint synaps tussen fotoreceptoren en tweede orde neuronen is bepalend voor de downstream overdracht van visuele informatie. De verticale opstelling van de plak zoogdierretina is een zeer waardevol instrument voor signaalverwerking studeren in verticale paden, dus tussen fotoreceptoren en bipolaire cellen en tussen bipolaire cellen en sommige soorten amacrine cellen 1, 2, 3, 4.
Echter, verticale snijbeweging zorgt steeds ernstige afknotting van de dendritische gebied van vele retinale neuronen, wat leidt tot aanzienlijk verlies van synaptische contacten. Vooral in de buitenste retina, zijn horizontale cellen beïnvloed door het lateraal verspreiden uitgebreide dendritische velden en axon terminal systemen 5. In een verticaleslice voorbereiding, de synaptische ingang van honderden kegel fotoreceptor terminals dendrieten horizontale cel wordt daarmee beperkt tot enkele kleine contacten. Dit kan voldoende zijn om de eigenschappen van individuele synapsen bestuderen, maar het doet geenszins vertegenwoordigt de signaalverwerking onderliggende gesynchroniseerde activering van fotoreceptor lint synapsen.
We ontwikkelden ook een horizontale slice voorbereiding, die bijna alle kegel fotoreceptor synaptische ingang overlaat aan horizontale cel dendrieten intact en functioneel. Het vlak van snijden loopt parallel aan het oppervlak van het netvlies, idealiter snijden door de binnenste kernlaag tussen horizontale cellen en amacrine cellen. Aldus worden horizontale segmenten van de buitenste retina gemaakt dat, op de presynaptische plaats, fotoreceptoren met binnen- en buitensegmenten en synaptische uiteinden en horizontale cellen en bipolaire cellen op de postsynaptische terrein. Deze voorbereiding is goed geschikt to onderzoeken gecoördineerde synaptische inputs in horizontale cel dendrieten door alle kegel fotoreceptoren binnen zijn dendritische veld. Het zou dus nuttig blijken om beter inzicht in de werking van de fotoreceptor lint synaps, die cruciaal is voor de overdracht van visuele informatie uit de matrix van fotoreceptor activering in een postsynaptische respons.
Protocol
Representative Results
Discussion
In tegenstelling tot de verticale segmenten, wordt de dendritische morfologie van radiaal georiënteerde neuronen zoals horizontale cellen en amacrine cellen goed bewaard gebleven. In vergelijking met hele retina preparaten, deze celtypen zijn gemakkelijk toegankelijk voor micro-elektroden en kan worden onderzocht door zowel elektrofysiologische en beeldvormende technieken. Hier hebben we ons gericht op de buitenste retina; echter, heeft een vergelijkbare benadering name gemeld voor amacrine cellen van de binnenste reti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG FOR701 and FE464/11-1 to A.F. The authors want to acknowledge the excellent technical assistance of Andrea Nerz.
Materials
| Ames' Medium | Sigma | A1420 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| Carbogen | Air Liquide | ||
| Agarose | Sigma | A9045 | |
| 35-mm petri dish (plastic) | Nunc Thermofisher | 150318 | |
| Glass petri dish | Chemoline | 50-1470-40 | |
| Isoflurane | Dispensary university hospital | ||
| Vibratome injector blade | Biosystems | 39053250 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200 | |
| Vibrocheck | Leica Microsystems | ||
| Microwave | |||
| Water bath | |||
| Forceps | |||
| 20-gauge needles | |||
| Spring scissors | |||
| Curved scalpel blades | |||
| Stereo microscope | |||
| Plastic Pasteur pipette | |||
| Glass Pasteur pipette |
References
- DeVries, S. H., Li, W., Saszik, S. Parallel processing in two transmitter microenvironments at the cone photoreceptor synapse. Neuron. 50, 735-748 (2006).
- Jackman, S. L., et al. Role of the synaptic ribbon in transmitting the cone light response. Nature Neuroscience. 12 (3), 303-310 (2009).
- Rabl, K., Cadetti, L., Thoreson, W. B. Kinetics of exocytosis is faster in cones than in rods. J. Neurosci. 25 (18), 4633-4640 (2005).
- Singer, J. H., Lassová, L., Vardi, N., Diamond, J. S. Coordinated multivesicular release at a mammalian ribbon synapse. Nature Neuroscience. 7 (8), 826-833 (2004).
- Peichl, L., González-Soriano, J. Morphological types of horizontal cell in rodent retinae: a comparison of rat, mouse, gerbil, and guinea pig. Vis. Neurosci. 11, 501-517 (1994).
- Ames, A., Nesbett, F. B. In vitro retina as an experimental model of the central nervous system. J. Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).
- Mathis, D. M., Furman, J. J., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J. Vis. Exp. (49), (2011).
- Peichl, L., Sandmann, D., Boycott, B. B. Comparative anatomy and function of mammalian horizontal cells. Development of the Retina. , (1998).
- Feigenspan, A., Babai, N. Functional properties of spontaneous excitatory currents and encoding of light/dark transitions in horizontal cells of the mouse retina. Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2615-2632 (2015).
- Enoki, R., Jakobs, T. C., Koizumi, A. Horizontal slice preparation of the retina. J. Vis. Exp. (1), e108 (2006).
- Babai, N., et al. Functional roles of complexin3 and complexin4 at mouse photoreceptor ribbon synapses. J. Neurosci. 36, 6651-6667 (2016).
- Thoreson, W. B. Horizontal slices of mouse retina expose horizontal cells and their properties (Commentary on Feigenspan & Babai). Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2613-2614 (2015).
