Подготовка горизонтальных слоев взрослых мышей Retina для электрофизиологических исследований
Summary
Мы разработали горизонтальный срез препарата сетчатки у млекопитающих взрослого с плоскостью секционирования параллельно поверхности сетчатки. Дендритные поля нерадиально ориентированных нейронов сетчатки не были усечены, что позволяет изучение обработки сигналов с накладными-смыкания и визуализации методов.
Abstract
Вертикальные препараты срезов хорошо разработаны для изучения схемы и передачи сигнала в сетчатке млекопитающих взрослого. Плоскость секционирования в этих препаратах, перпендикулярно к поверхности сетчатки, что делает его идеальным для изучения радиально ориентированных нейронов, таких как фоторецепторов и биполярных клеток. Тем не менее, крупные дендритные беседок горизонтальных клеток, клеток амакринных широкоугольных и ганглиозных клеток в основном усеченный, в результате чего заметно пониженную синаптической активности в этих клетках. В то время как ганглиозные клетки и перемещенные амакринные клетки могут быть изучены в целом монтажа подготовки сетчатки, горизонтальные клетки и амакринные клетки, расположенные во внутреннем ядерном слое лишь слабо доступны для электродов в цельной ткани сетчатки глаза.
Для достижения максимальной доступности и синаптическую целостности, мы разработали горизонтальную подготовку срезов сетчатки мыши, а также изучал передачу сигнала в синапсах между фоторецепторов и горизонтальнымклетки. Горизонтальное секционирование позволяет (1) простой и однозначный визуальной идентификации горизонтальных клеточных тел для электрода адресности и (2) сохранение расширенной горизонтальной ячейки дендритных полей, в качестве предпосылки для неповрежденного и функционального конуса синаптической вход горизонтальных дендритов клеток.
Горизонтальные клетки из горизонтальных слоев выставлены тонизирующее синаптической активности в темноте, и они ответили на короткие световые вспышки с уменьшением внутреннего тока и пониженной синаптической активности. Иммуноцитохимическая данные свидетельствуют о том, что почти все конусы в пределах дендритной области горизонтальной ячейки установить синапсы с его периферийными дендритов. Горизонтальный срез подготовка поэтому хорошо подходит для изучения физиологических свойств горизонтально протяженных нейронов сетчатки, а также сенсорную передачу сигнала и интеграции между выбранными синапсов.
Introduction
Визуальная информация кодируется как динамический пространственно-временной паттерн активации фоторецепторов, и лента синапс между фоторецепторов и нейронов второго порядка определяет передачу вниз по течению визуальной информации. Вертикальная подготовка срез сетчатки млекопитающего является весьма ценным инструментом для изучения обработки сигналов в вертикальных путей, то есть между фоторецепторов и биполярных клеток, а также между биполярными клетками и некоторыми типами амакринных ячейки 1, 2, 3, 4.
Тем не менее, вертикальные секционирования всегда вызывает сильную усечение дендритных полей многих нейронов сетчатки, что приводит к значительной потере синаптических контактов. Особенно во внешней сетчатки, горизонтальные клетки страдают из – за их в боковом направлении распространяются расширенных дендритных полей и аксона систем 5. В вертикальномПодготовка ломтик, синаптической вход сотен колбочек терминалов к дендритов горизонтальной ячейки, таким образом, сводится к нескольким разреженных контактов. Это может быть достаточно, чтобы изучить свойства отдельных синапсов, но это ни в коей мере не представляют возможности обработки сигналов, лежащих в основе синхронизированного активацию фоторецепторов ленты синапсов.
Поэтому мы разработали горизонтальный срез препарат, который оставляет почти все фоторецепторов конуса синаптическую вход для горизонтальных дендритов клеток нетронутыми и функциональным. Самолет секционирования проходит параллельно поверхности сетчатки, идеально прорезая внутреннего ядерного слоя между горизонтальными клетками и клетками амакринных. Таким образом, горизонтальные срезы внешней сетчатки создаются, содержащие, на пресинаптической месте, фоторецепторов с внутренними и внешними сегментами, а также синаптических окончаний, а также горизонтальные клетки и биполярные клетки на постсинаптической месте. Этот препарат хорошо подходит тO исследовать скоординированные синаптические входы в горизонтальные дендриты клеток всеми колбочек фоторецепторов в пределах своей дендритных поля. Таким образом, она может оказаться полезным, чтобы лучше понять работу фоторецепторов лентой синапса, которая имеет решающее значение для передачи визуальной информации из матрицы активации фоторецепторов в постсинаптической ответ.
Protocol
Representative Results
Discussion
В отличие от вертикальных срезов, дендритные морфология радиально ориентированных нейронов как горизонтальных клеток и клеток амакринных хорошо сохранились. По сравнению с целыми сетчатка препаратов, эти типы клеток легко доступны для микроэлектродов и могут быть изучены с помощью ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG FOR701 and FE464/11-1 to A.F. The authors want to acknowledge the excellent technical assistance of Andrea Nerz.
Materials
| Ames' Medium | Sigma | A1420 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| Carbogen | Air Liquide | ||
| Agarose | Sigma | A9045 | |
| 35-mm petri dish (plastic) | Nunc Thermofisher | 150318 | |
| Glass petri dish | Chemoline | 50-1470-40 | |
| Isoflurane | Dispensary university hospital | ||
| Vibratome injector blade | Biosystems | 39053250 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200 | |
| Vibrocheck | Leica Microsystems | ||
| Microwave | |||
| Water bath | |||
| Forceps | |||
| 20-gauge needles | |||
| Spring scissors | |||
| Curved scalpel blades | |||
| Stereo microscope | |||
| Plastic Pasteur pipette | |||
| Glass Pasteur pipette |
References
- DeVries, S. H., Li, W., Saszik, S. Parallel processing in two transmitter microenvironments at the cone photoreceptor synapse. Neuron. 50, 735-748 (2006).
- Jackman, S. L., et al. Role of the synaptic ribbon in transmitting the cone light response. Nature Neuroscience. 12 (3), 303-310 (2009).
- Rabl, K., Cadetti, L., Thoreson, W. B. Kinetics of exocytosis is faster in cones than in rods. J. Neurosci. 25 (18), 4633-4640 (2005).
- Singer, J. H., Lassová, L., Vardi, N., Diamond, J. S. Coordinated multivesicular release at a mammalian ribbon synapse. Nature Neuroscience. 7 (8), 826-833 (2004).
- Peichl, L., González-Soriano, J. Morphological types of horizontal cell in rodent retinae: a comparison of rat, mouse, gerbil, and guinea pig. Vis. Neurosci. 11, 501-517 (1994).
- Ames, A., Nesbett, F. B. In vitro retina as an experimental model of the central nervous system. J. Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).
- Mathis, D. M., Furman, J. J., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J. Vis. Exp. (49), (2011).
- Peichl, L., Sandmann, D., Boycott, B. B. Comparative anatomy and function of mammalian horizontal cells. Development of the Retina. , (1998).
- Feigenspan, A., Babai, N. Functional properties of spontaneous excitatory currents and encoding of light/dark transitions in horizontal cells of the mouse retina. Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2615-2632 (2015).
- Enoki, R., Jakobs, T. C., Koizumi, A. Horizontal slice preparation of the retina. J. Vis. Exp. (1), e108 (2006).
- Babai, N., et al. Functional roles of complexin3 and complexin4 at mouse photoreceptor ribbon synapses. J. Neurosci. 36, 6651-6667 (2016).
- Thoreson, W. B. Horizontal slices of mouse retina expose horizontal cells and their properties (Commentary on Feigenspan & Babai). Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2613-2614 (2015).
