Utarbeidelse av Horisontale Skiver av Adult Mouse Retina for Elektro Studies
Summary
Vi har utviklet en horisontal skive fremstilling av den voksne pattedyr hinnen med planet til seksjonering parallelt med retinal overflaten. Dendrittiske felt av nonradially orienterte netthinnens nerveceller ble ikke avkortet, slik at studiet av signalbehandling med patch-clamp og avbildningsteknikker.
Abstract
Vertikale skive forberedelsene er godt etablert for å studere kretser og signaloverføring i den voksne pattedyr netthinnen. Planet for seksjonering i disse preparater, er vinkelrett på retinal overflaten, noe som gjør den ideell for studiet av radialt orienterte neuroner som fotoreseptorene og bipolare celler. Imidlertid, den store dendrittiske arbors av horisontale celler, bred-felt amacrine celler, og ganglion-celler er stort sett avkortet, slik markert redusert synaptisk aktivitet i disse cellene. Mens ganglion celler og ford amacrine celler kan studeres på en helt montert utarbeidelse av netthinnen, horisontale celler og amacrine celler lokalisert i det indre kjernefysiske lag er bare dårlig tilrettelagt for elektroder i hele netthinnen vev.
For å oppnå maksimal tilgjengelighet og synaptisk integritet, har vi utviklet en horisontal skive forberedelse av musen netthinnen, og studerte signaloverføring ved synapse mellom fotoreseptorene og horisontalceller. Horisontal seksjonering tillater (1) enkel og entydig visuell identifisering av horisontale celle organer for elektrode målretting, og (2) bevaring av den utvidede horisontal celle dendrittiske felt, som en forutsetning for intakt og funksjonell kjegle synaptic innspill til horisontale celle dendritter.
Horisontale celler fra horisontale skiver utstilt tonic synaptisk aktivitet i mørket, og de svarte på korte lysglimt med en reduksjon av innover strøm og redusert synaptisk aktivitet. Immunocytokjemisk bevis indikerer at nesten alle kjeglene i den dendrittiske felt av en horisontal celle etablere synapser med sine perifere dendritter. Den horisontale slice forberedelse er derfor godt egnet til å studere fysiologiske egenskaper horisontalt utvidet retinal nevroner samt sensorisk signaloverføring og integrasjon på tvers av utvalgte synapser.
Introduction
Visuell informasjon er kodet som en dynamisk rom-tid-mønster av fotoreseptoren aktivering, og båndet synapse mellom fotoreseptorene og andre-ordens nevroner bestemmer nedstrøms overføring av visuell informasjon. Den vertikale skive fremstilling av pattedyr hinnen er et meget verdifullt verktøy for å studere signalbehandling i vertikale baner, det vil si mellom fotoreseptorene og bipolare celler, og mellom bipolare celler og noen typer amacrine celle en, to, tre, fire.
Men vertikal seksjonering alltid fører alvorlig avkutting av de dendrittiske felt av mange netthinnens nerveceller, som fører til betydelig tap av synaptiske kontakter. Spesielt i ytre netthinnen, er horisontale celler berørt på grunn av sine lateralt spredt lengre dendrittiske felt og axon terminalsystemer 5. I en vertikalskive preparat, den synaptiske input av hundrevis av kjegle fotoreseptoren terminalene til dendrittene av en horisontal celle er således redusert til noen få spredte kontakter. Dette kan være nok til å studere egenskapene til enkelte synapser, men det gjør på ingen måte representerer de signalbehandling evner ligger til grunn for synkronisert aktivering av fotoreseptoren bånd synapser.
Vi har derfor utviklet en horisontal skive preparat, som etterlater nesten alt av konusen fotoreseptoren synaptiske inngang til horisontale celle dendritter intakt og funksjonelt. Planet for seksjonering løper parallelt med overflaten av netthinnen, ideelt sett å skjære gjennom det indre kjernesjikt mellom horisontale celler og amacrine celler. Således er horisontale skiver av den ytre retina opprettes inneholdende, på den presynaptiske området, fotoreseptorer med indre og ytre segmenter samt synaptiske terminaler, og horisontale celler og bipolare celler på den postsynaptiske området. Dette preparatet er godt egnet to undersøke koordinerte synaptiske input i horisontale celle dendritter av alle kjegle fotoreseptorene innenfor sitt dendrittiske felt. Det derfor kan være nyttig for å bedre forstå virkefotoreseptoren bånd synapse, noe som er avgjørende for overføring av visuell informasjon fra matrise av fotoreseptoren aktivisering til en postsynaptisk respons.
Protocol
Representative Results
Discussion
I motsetning til vertikale skiver, er dendrittiske morfologien av radialt orienterte neuroner som horisontale celler og celler amacrine vel bevart. Sammenlignet med hele netthinnen forberedelser, disse celletypene er lett tilgjengelig for mikroelektroder og kan studeres av både elektrofysiologiske og avbildningsteknikker. Her fokuserte vi på den ytre hinnen; derimot, har en lignende tilnærming blitt rapportert spesielt for amacrine cellene i indre netthinne 10.
Ege…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG FOR701 and FE464/11-1 to A.F. The authors want to acknowledge the excellent technical assistance of Andrea Nerz.
Materials
| Ames' Medium | Sigma | A1420 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| Carbogen | Air Liquide | ||
| Agarose | Sigma | A9045 | |
| 35-mm petri dish (plastic) | Nunc Thermofisher | 150318 | |
| Glass petri dish | Chemoline | 50-1470-40 | |
| Isoflurane | Dispensary university hospital | ||
| Vibratome injector blade | Biosystems | 39053250 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200 | |
| Vibrocheck | Leica Microsystems | ||
| Microwave | |||
| Water bath | |||
| Forceps | |||
| 20-gauge needles | |||
| Spring scissors | |||
| Curved scalpel blades | |||
| Stereo microscope | |||
| Plastic Pasteur pipette | |||
| Glass Pasteur pipette |
References
- DeVries, S. H., Li, W., Saszik, S. Parallel processing in two transmitter microenvironments at the cone photoreceptor synapse. Neuron. 50, 735-748 (2006).
- Jackman, S. L., et al. Role of the synaptic ribbon in transmitting the cone light response. Nature Neuroscience. 12 (3), 303-310 (2009).
- Rabl, K., Cadetti, L., Thoreson, W. B. Kinetics of exocytosis is faster in cones than in rods. J. Neurosci. 25 (18), 4633-4640 (2005).
- Singer, J. H., Lassová, L., Vardi, N., Diamond, J. S. Coordinated multivesicular release at a mammalian ribbon synapse. Nature Neuroscience. 7 (8), 826-833 (2004).
- Peichl, L., González-Soriano, J. Morphological types of horizontal cell in rodent retinae: a comparison of rat, mouse, gerbil, and guinea pig. Vis. Neurosci. 11, 501-517 (1994).
- Ames, A., Nesbett, F. B. In vitro retina as an experimental model of the central nervous system. J. Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).
- Mathis, D. M., Furman, J. J., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J. Vis. Exp. (49), (2011).
- Peichl, L., Sandmann, D., Boycott, B. B. Comparative anatomy and function of mammalian horizontal cells. Development of the Retina. , (1998).
- Feigenspan, A., Babai, N. Functional properties of spontaneous excitatory currents and encoding of light/dark transitions in horizontal cells of the mouse retina. Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2615-2632 (2015).
- Enoki, R., Jakobs, T. C., Koizumi, A. Horizontal slice preparation of the retina. J. Vis. Exp. (1), e108 (2006).
- Babai, N., et al. Functional roles of complexin3 and complexin4 at mouse photoreceptor ribbon synapses. J. Neurosci. 36, 6651-6667 (2016).
- Thoreson, W. B. Horizontal slices of mouse retina expose horizontal cells and their properties (Commentary on Feigenspan & Babai). Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2613-2614 (2015).
