능성의 효율적인 분화 NKX6-1에 줄기 세포<sup> +</sup> 췌장 전구 세포
Summary
여기에서는 시험 관내 NKX6-1 + 췌장 전구 세포에 인간 배아 줄기 세포가 분화하는 4 단째의 프로토콜을 설명한다. 이 프로토콜은, 인간 다 능성 줄기 세포의 종류에 적용될 수있다.
Abstract
다 능성 줄기 세포는 자기를 갱신하고의 연구 및 미래 당뇨병 치료에 사용될 수있는 췌장 선조 세포의 생성을위한 매력적인 소스 만드는 다중 계통으로 분화하는 능력을 가지고있다. 이 문서에서는 인간 배아 줄기 세포 (hESCs는)에서 췌장 전구 세포를 생성하도록 설계된 4 단계의 분화 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은, 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSC) 라인의 수에 적용 할 수있다. 췌장 전구 세포를 생성하기 위해 취해진 방식은 정확하게 췌장 개발의 주요 단계를 모델링 hESCs는 구별한다. 이것은 티빈 A, 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF에) 및 CHIR990210의 존재 하에서 세포를 배양함으로써 달성되는 최종 내배엽의 유도와 함께 시작된다. 섬유 아세포 성장 인자 10 (FGF10) 및 Dorsomorphin와 또한 차별화 및 패터닝 후방 foregut를 닮은 세포를 생성합니다. 레틴의 추가OIC 산, 소량는 SANT-1과 FGF10은 췌장 내배엽의 특성 세포로 후방 foregut 세포를 구별합니다. 마지막으로, 표피 성장 인자 (EGF)의 조합은, 니코틴 및 소량은 PDX1 + / NKX6-1 + 세포의 효율적인 생성을 이끈다. 유동 세포 계측법 췌장 개발의 주요 단계에서 특이 마커의 발현을 확인하기 위해 수행된다. 스테이지 (4)의 끝에 PDX1 + / + 췌장 선조 NKX6-1은 면역 결핍 마우스에 이식시 성숙한 β 세포를 발생시킬 수 있으며 상기 체외 인슐린 생성 세포를 생성하기 위해 구별된다. 따라서, PDX1의 효율적인 생성 + / NKX6-1 + 췌장 전구 세포,이 프로토콜에서 입증 된 바와 같이,이 시험 관내에서 인간의 췌장 개발을 연구하기위한 플랫폼을 제공하기 때문에 매우 중요하고 분화 잠재력 세포의 공급원을 제공한다 EV 수 β 세포entually 당뇨병 치료에 이용 될 수있다.
Introduction
당뇨병의 유병률은 증가하고 캐나다 당뇨병 협회에 따르면, 제 1 형 당뇨병 (T1D) 1을 가진이 개인의 5 ~ 10 %로, 캐나다에서 만 11 이상의 개인이 당뇨병 또는 당뇨병 진단 전의 것으로 추정된다. T1D는 랑게르한스섬 내에 위치 인슐린 생성 β 세포의 파괴에 의해 야기 된자가 면역 질환이다. 현재 T1D 함께 사는 사람들은 인슐린이의 외인성 소스를 필요로한다. 인슐린 치료에서의 진보에도 불구하고, T1D 환자는 혈당 수치를 조절하는데 어려움이 있고 하이포 고혈당 모두 고생 계속합니다. 치료의 유망한 형태는 T1D에서 정상 혈당이 생체 내 및 시험 관내 3 모두 β 세포의 인슐린 생산의 무제한 공급을 생성하는데 사용될 수있는 인간 배아 줄기 세포 (hESCs는)의 사용이다 복원 <s클래스 = "외부 참조"> 4, 5, 6, 7까지. hESCs는 차별화하는 β-같이하는 세포는 가능한 제 2 형 당뇨병에 대한 새로운 치료 표적의 식별을 허용, 시험 관내에서 당뇨병을 연구하고 T1D 환자에 이식 세포를 제공하기 위해 만들 수 있습니다.
체외에서 hESCs는에서 인슐린 생산 세포를 생성에서 가장 성공적인 시도는 췌장 개발 4, 5시에 발생하는 배아 이벤트를 요점을 되풀이하는 것입니다. 이것은 정확하게 현상 췌장의 주요 단계를 모델링 별개의 신호 경로의 조작을 포함한다. 췌장 개발은 CXCR4 및 CD117 (C-KIT) 8, 9의 발현을 특징으로 최종 내배엽의 유도로 시작합니다. definit의 정확한 조절필자 내배엽 조직은 다음 전방 – – 후방 및 복부 – 등의 패턴 거쳐 창자 관의 형성이 필요합니다. 지느러미와 복부 췌장 싹이 췌장 개발 (10)에 필요한 췌장과 십이지장 호 메오 박스 유전자 (Pdx1)를 표현하는 후방 foregut의 영역에서 등장. 지느러미와 복부 싹 퓨즈는 광범위한 상피 리모델링 및 확장 (11)를 거쳐 췌장을 형성한다. 내분비 및 외분비 혈통에 의지가 표현하는 다 능성 전구 세포 (MPC와)의 생성을 동반, 다른 사람의 사이에서, 전사는 Pdx1, Nkx6.1 및 Ptf1a 12, 13 요인. 내분비 및 유관 세포가 될 것이다 MPC와는 Ptf1a 식을 줄이면서 Nkx6-1을 표현하는 것을 계속한다. 이에 대하여, 외분비 혈통 세포는 expressio 잃게됩니다Nkx6-1의 n 및 Ptf1a 식 (12)을 유지한다.
전사 인자 Nkx6-1 특히 세포와 β 내분비 전구 세포의 분화 과정, 췌장 발달에 중요한 역할을한다. 이전 췌장 개발 14 중 β 세포 장애가 형성 Nkx6-1 결과, 결실 한 바와 같이. 따라서, 생체 외 및 생체 내 인슐린 생성 β 세포를 발생시키는 Nkx6-1의 효율적인 도입을 필요로한다.
우리는 최근에 효율적으로 hPSCs에서 PDX1 + / NKX6-1 + 췌장 전구 세포를 생성 할 수있는 프로토콜을 개발했다. 이 hPSC 파생 췌장 전구 세포는 면역 결핍 마우스 3에 이식에 따라 성숙 β 세포를 생성합니다. 1) 최종 내배엽 유도 : 분화 프로토콜 4로 분할 될 수 특징 스테이지2) 후방 foregut 패터닝, 3) 췌장 사양 및 4) NKX6-1 유도. 여기서 우리는 분화 방향의 각 단계에 대한 상세한 설명을 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
성공적으로 시험 관내에서 hPSCs에서 NKX6-1 + 췌장 전구 세포를 생성하는 췌장 개발 과정에서 중요한 발달 단계를 관리하는 특정 신호 전달 경로의 정확한 규정을 포함 hPSCs의 높은 품질의 문화와 감독 분화의 사용에 의존한다. 이전에 다음과 같은 고려가 이루어져야 NKX6-1 효율적인 생성을 위해, 3이 나타내는 바와 같이 프로토콜 hPSC 라인의 다양한 걸쳐 NKX6-1의 강력?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 원고는 토론토 일반과 서양 재단과 밴팅 & 베스트 당뇨병 센터 – 대학 건강 네트워크 대학원 수상에서 자금에 의해 지원되었다.
Materials
| Media and cytokines | |||
| 1-Thioglycerol (MTG) | Sigma | M6145 | |
| Activin A | R&D | 338-AC/CF | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Buffer | BD Bioscience | 554722 | |
| BD Perm/Wash buffer, 1x | BD Bioscience | 554723 | |
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| CHIR990210 | Tocris | 4423a | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995 | |
| DNase I | VWR | 80510-412 | |
| Dorsomorphin | Sigma | P5499 | |
| EGF | R&D | 236-EG | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 88150 | |
| FGF10 | R&D | 345-FG | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G1890 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Nicotinamide | Sigma | NO636 | |
| NOGGIN | R&D | 3344-NG | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875 | |
| SANT-1 | Tocris | 1974 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Life Technologies | 12605-010 | |
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Antibodies for flow cytometry (working dilutions) | |||
| CD117 PE (1:100) | Life Technologies | CD11705 | |
| CXCR4 APC (1:50) | BD Bioscience | 551966 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugate (1:400) | Life Technologies | A-31571 | |
| Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 705-546-147 | |
| Isotype Control Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 015-000-003 | |
| Isotype Control Goat IgG | R&D | AB-108-C | |
| NKX6-1 (1:2000) | DSHB | F55A10 | |
| PDX1 (1:100) | R&D | AF2419 |
References
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