Diferenciação eficiente dos Pluripotent Stem Cells para NKX6-1<sup> +</sup> Progenitores pancreáticas
Summary
Aqui nós descrevemos um protocolo de 4 estágios para diferenciar as células-tronco embrionárias humanas para NKX6-1 + progenitoras pancreáticas in vitro. Este protocolo pode ser aplicado a uma variedade de linhas de células estaminais pluripotentes humanas.
Abstract
As células estaminais pluripotentes têm a capacidade de auto-renovação e diferenciação de várias linhagens, o que os torna numa fonte atraente para a geração de células progenitoras pancreáticas que pode ser usado para o estudo e tratamento futuro da diabetes. Este artigo descreve um protocolo de diferenciação de quatro estágios concebido para gerar células progenitoras pancreáticas de células estaminais embrionárias humanas (hESCs). Este protocolo pode ser aplicado a um certo número de linhas de células pluripotentes estaminais humanas (HPSC). A abordagem adoptada para gerar células progenitoras pancreáticas é diferenciar hESCs para modelar com precisão as principais fases do desenvolvimento pancreático. Isto começa com a indução da endoderme definitiva, o que é conseguido através da cultura das células na presença de Activina A, Factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) e CHIR990210. Maior diferenciação e padronização com Fator de Crescimento 10 (FGF10) e Dorsomorphin gera células que se assemelham a foregut posterior. A adição de RetinÓico, NOGGIN, SANT-1 e FGF10 diferencia células foregut posterior em células característicos da endoderme pancreático. Finalmente, a combinação do factor de crescimento epidérmico (EGF), a nicotinamida e NOGGIN conduz à geração eficiente de Pdx1 + / + NKX6-1 células. A citometria de fluxo é realizada para confirmar a expressão de marcadores específicos em estágios fundamentais do desenvolvimento pancreático. Os NKX6-1 + / + progenitores pancreáticas Pdx1 no final do estágio 4 são capazes de gerar células beta maduras após transplante em ratinhos imunodeficientes e pode ser ainda mais diferenciado para gerar células produtoras de insulina in vitro. Assim, a geração eficiente de Pdx1 + / NKX6-1 + progenitoras pancreáticas, como demonstrado neste protocolo, é de grande importância, pois proporciona uma plataforma para estudar o desenvolvimento pancreático humano in vitro e fornece uma fonte de células com o potencial de se diferenciar a células beta que poderia eVentually ser utilizado para o tratamento de diabetes.
Introduction
A prevalência de diabetes está a aumentar e de acordo com a Canadian Diabetes Association, estima-se que mais de 11 milhões de pessoas no Canadá são diabéticos ou pré-diabéticos, com 5-10% destes indivíduos com diabetes tipo 1 (DM1) 1. DM1 é uma doença auto-imune que é causada pela destruição das células beta produtoras de insulina que estão localizados dentro das ilhotas de Langerhans. Atualmente, as pessoas que vivem com DM1 necessitam de fontes exógenas de insulina 2. Apesar dos avanços na terapia com insulina, os pacientes DM1 continuar a ter um tempo difícil regular os seus níveis de glicose no sangue e continuam a sofrer tanto hipo e hiperglicemia. Uma forma promissora de tratamento para restabelecer a normoglicemia em DM1 é a utilização de células estaminais embrionárias humanas (hESCs), que poderiam ser utilizados para gerar um fornecimento ilimitado de células beta produtoras de insulina tanto in vivo como in vitro 3, <s-se class = "xref"> 4, 5, 6, 7. Diferenciando hESCs a p-como células poderia tornar possível o estudo de diabetes in vitro, permitindo a identificação de novos alvos terapêuticos para a diabetes tipo 2 e proporcionar células para transplante em pacientes com DM1.
A tentativa mais bem sucedida na geração de células produtoras de insulina a partir de hESCs in vitro é de recapitular os eventos embrionárias que ocorrem durante o desenvolvimento pancreático 4, 5. Isso envolve a manipulação de vias de sinalização distintas para modelar com precisão as principais fases do pâncreas em desenvolvimento. Desenvolvimento pancreático começa com a indução da endoderme definitivo, que se caracteriza pela expressão de CXCR4 e CD117 (c-kit) 8, 9. regulação precisa da definitive organização endoderme é necessário para a formação do tubo digestivo, a qual é então submetida a anterior para posterior padronização e ventral-dorsal. A dorsal e ventral do pâncreas gomos emergir a partir da região do intestino anterior posterior, que expressa o gene homeobox pancreático e duodenal (Pdx1), que é necessária para o desenvolvimento pancreático 10. O dorsal e ventral gomos fundem para formar o pâncreas, que depois sofre uma extensa remodelação epitelial e expansão 11. Compromisso com o sistema endócrino e exócrino linhagem é acompanhada pela geração de células progenitoras multipotentes (PPM) que expressam, entre outros, os factores de transcrição Pdx1, Nkx6.1 e Ptf1a 12, 13. PPM que se tornarão células endócrinas e ductal continuam a expressar Nkx6-1 enquanto diminui a expressão Ptf1a. Contrariamente a isto, as células de linhagem exócrinas perderá expressioN de Nkx6-1 e manter a expressão Ptf1a 12.
O factor de transcrição Nkx6-1 tem um papel chave no desenvolvimento pancreático, particularmente durante a diferenciação de células progenitoras endócrinas para células p. Como descrito anteriormente, a exclusão de Nkx6-1 resulta na formação diminuída de células beta do pâncreas 14 durante o desenvolvimento. Portanto, a geração de células p produtoras de insulina, tanto in vitro e in vivo requer a indução eficiente de Nkx6-1.
Recentemente, desenvolveu um protocolo para gerar eficiência Pdx1 + / NKX6-1 + progenitoras pancreáticas de hPSCs. Estes progenitores pancreáticas HPSC derivados de gerar células beta maduras em cima do transplante em ratinhos imunodeficientes 3. O protocolo de diferenciação pode ser dividida em quatro etapas características de: 1) indução endoderme definitiva, 2) padronização foregut posterior, 3) especificação de pâncreas e 4) a indução NKX6-1. Aqui nós fornecemos uma descrição detalhada de cada passo da diferenciação dirigida.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gerando sucesso NKX6-1 + progenitoras pancreáticas de hPSCs in vitro baseia-se no uso de culturas de alta qualidade de hPSCs e diferenciação dirigida envolvendo a regulação precisa de vias de sinalização específicas que regem as principais fases de desenvolvimento durante o desenvolvimento pancreático. Embora este protocolo pode ser utilizado para induzir a expressão robusta de NKX6-1 através de uma variedade de linhas HPSC como previamente mostrado 3, para assegura…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este manuscrito foi apoiado pelo financiamento do Toronto General e Fundação Ocidental e o Prêmio de Pós-Graduação Banting e Melhor Diabetes Centre-University Health Network.
Materials
| Media and cytokines | |||
| 1-Thioglycerol (MTG) | Sigma | M6145 | |
| Activin A | R&D | 338-AC/CF | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Buffer | BD Bioscience | 554722 | |
| BD Perm/Wash buffer, 1x | BD Bioscience | 554723 | |
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| CHIR990210 | Tocris | 4423a | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995 | |
| DNase I | VWR | 80510-412 | |
| Dorsomorphin | Sigma | P5499 | |
| EGF | R&D | 236-EG | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 88150 | |
| FGF10 | R&D | 345-FG | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G1890 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Nicotinamide | Sigma | NO636 | |
| NOGGIN | R&D | 3344-NG | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875 | |
| SANT-1 | Tocris | 1974 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Life Technologies | 12605-010 | |
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Antibodies for flow cytometry (working dilutions) | |||
| CD117 PE (1:100) | Life Technologies | CD11705 | |
| CXCR4 APC (1:50) | BD Bioscience | 551966 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugate (1:400) | Life Technologies | A-31571 | |
| Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 705-546-147 | |
| Isotype Control Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 015-000-003 | |
| Isotype Control Goat IgG | R&D | AB-108-C | |
| NKX6-1 (1:2000) | DSHB | F55A10 | |
| PDX1 (1:100) | R&D | AF2419 |
References
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