La diferenciación eficiente de pluripotentes células madre a NKX6-1<sup> +</sup> Progenitores pancreáticas
Summary
Aquí se describe un protocolo de 4 etapas para diferenciar células madre embrionarias humanas para NKX6-1 + progenitoras pancreáticas in vitro. Este protocolo se puede aplicar a una variedad de líneas de células madre pluripotentes humanas.
Abstract
Las células madre pluripotentes tienen la capacidad de auto renovarse y diferenciarse a múltiples linajes, por lo que una fuente atractiva para la generación de células progenitoras pancreáticas que se puede utilizar para el estudio de y el tratamiento futuro de la diabetes. En este artículo se describe un protocolo de diferenciación de cuatro etapas diseñado para generar células pancreáticas progenitoras a partir de células madre embrionarias humanas (hESCs). Este protocolo se puede aplicar a una serie de líneas de células madre pluripotentes humano (HPSC). El enfoque adoptado para generar células progenitoras pancreáticas es diferenciar hESCs para modelar con precisión las etapas clave del desarrollo de páncreas. Esto comienza con la inducción de la endodermo definitivo, que se consigue cultivando las células en presencia de activina A, factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF) y CHIR990210. Una mayor diferenciación y el patrón con el factor de crecimiento de fibroblastos 10 (FGF10) y Dorsomorphin genera células se asemejan al intestino anterior posterior. La adición de RetinOico, NOGGIN, SANT-1 y FGF10 diferencia a las células del intestino anterior posterior en las células propias del endodermo pancreático. Finalmente, la combinación de Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF), nicotinamida y NOGGIN conduce a la generación eficiente de PDX1 + / + NKX6-1 células. La citometría de flujo se realiza para confirmar la expresión de marcadores específicos en las etapas clave del desarrollo de páncreas. Los + / + NKX6-1 progenitores pancreáticos PDX1 al final de la etapa 4 son capaces de generar células beta maduras en el trasplante dentro ratones inmunodeficientes y pueden diferenciarse además para generar células productoras de insulina in vitro. Por lo tanto, la generación eficiente de PDX1 + / + NKX6-1 progenitores pancreáticos, como se demuestra en este protocolo, es de gran importancia, ya que proporciona una plataforma para estudiar el desarrollo de páncreas humano in vitro y proporciona una fuente de células con el potencial de diferenciarse de células ß que podrían eVentually ser utilizado para el tratamiento de la diabetes.
Introduction
La prevalencia de la diabetes está en aumento y según la Asociación Canadiense de Diabetes, se estima que más de 11 millones de personas en Canadá son diabéticos o prediabéticos, con 5-10% de estas personas que tienen diabetes tipo 1 (DM1) 1. T1D es una enfermedad autoinmune que se produce por la destrucción de las células beta productoras de insulina que se encuentran dentro de los islotes de Langerhans. En la actualidad, las personas que viven con diabetes tipo 1 requieren fuentes exógenas de la insulina 2. A pesar de los avances en la terapia con insulina, los pacientes T1D siguen teniendo dificultades para regular sus niveles de glucosa en sangre y continúan sufriendo tanto hipoglucemia y la hiperglucemia. Una forma prometedora de tratamiento para restaurar la normoglucemia en T1D es el uso de células madre embrionarias humanas (hESCs), que podrían utilizarse para generar un suministro ilimitado de células productoras de ß tanto in vivo como in vitro 3 insulina, <shasta class = "xref"> 4, 5, 6, 7. La diferenciación de hESCs a ß-como las células podrían hacer posible el estudio de la diabetes in vitro, lo que permite la identificación de nuevas dianas terapéuticas para la diabetes tipo 2 y proporcionar células para el trasplante en pacientes T1D.
El intento más exitoso en la generación de células productoras de insulina a partir de hESCs in vitro es de recapitular los eventos embrionarias que se producen durante el desarrollo de páncreas 4, 5. Esta consiste en la manipulación de distintas vías de señalización para modelar con precisión las etapas clave del páncreas en desarrollo. Desarrollo pancreático comienza con la inducción de la endodermo definitivo, que se caracteriza por la expresión de CXCR4 y CD117 (c-KIT) 8, 9. La regulación precisa de DefinitSe requiere organización endodermo ive para la formación del tubo intestinal, que a continuación se somete anterior-a-posterior patrón y-ventral dorsal. El dorsal y las yemas de páncreas ventral emergen de la región del intestino anterior posterior que expresa el gen homeobox pancreática y duodenal (Pdx1), que es necesaria para el desarrollo de páncreas 10. El dorsal y ventral brotes se fusionan para formar el páncreas, que luego se somete a una amplia remodelación epitelial y expansión 11. Compromiso con el endocrino y exocrino linaje va acompañada de la generación de células progenitoras multipotentes (PSM) que expresan, entre otros, los factores de transcripción Pdx1, Nkx6.1 y Ptf1a 12, 13. PSM que se convertirán en células endocrinas y ductales continúan expresando Nkx6-1 la vez que disminuye la expresión Ptf1a. Contrariamente a esto, las células exocrinas del linaje perderán expression de Nkx6-1 y mantener la expresión Ptf1a 12.
El factor de transcripción Nkx6-1 tiene un papel clave en el desarrollo de páncreas, particularmente durante la diferenciación de las células progenitoras endocrinas a las células ß. Como se ha descrito anteriormente, la supresión de los resultados en la formación de Nkx6-1 deteriorada de las células beta durante el desarrollo de páncreas 14. Por lo tanto, la generación de células beta productoras de insulina tanto in vitro como in vivo requiere la inducción eficiente de Nkx6-1.
Recientemente hemos desarrollado un protocolo para generar eficientemente PDX1 + / + NKX6-1 progenitores pancreáticos de hPSCs. Estos progenitores pancreáticos derivados de HPSC generan células beta maduras en el trasplante dentro ratones inmunodeficientes 3. El protocolo de diferenciación se puede dividir en 4 etapas características de: 1) la inducción endodermo definitivo, 2) el patrón posterior intestino anterior, 3) la especificación de páncreas y 4) la inducción NKX6-1. A continuación se realiza una descripción detallada de cada paso de la diferenciación dirigida.
Protocol
Representative Results
Discussion
Generar con éxito NKX6-1 + progenitores pancreáticos de hPSCs in vitro se basa en el uso de cultivos de alta calidad de hPSCs y diferenciación dirigida que implican la regulación precisa de determinadas vías de señalización que regulan etapas de desarrollo clave durante el desarrollo de páncreas. Aunque este protocolo se puede utilizar para inducir la expresión robusta de NKX6-1 través de una variedad de líneas de HPSC como se muestra previamente 3, para asegurar la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este manuscrito fue financiada por la Fundación General de Toronto y Occidental y el Premio de Graduados Red de Salud Banting y Best Diabetes Centro-Universidad.
Materials
| Media and cytokines | |||
| 1-Thioglycerol (MTG) | Sigma | M6145 | |
| Activin A | R&D | 338-AC/CF | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Buffer | BD Bioscience | 554722 | |
| BD Perm/Wash buffer, 1x | BD Bioscience | 554723 | |
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| CHIR990210 | Tocris | 4423a | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995 | |
| DNase I | VWR | 80510-412 | |
| Dorsomorphin | Sigma | P5499 | |
| EGF | R&D | 236-EG | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 88150 | |
| FGF10 | R&D | 345-FG | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G1890 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Nicotinamide | Sigma | NO636 | |
| NOGGIN | R&D | 3344-NG | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875 | |
| SANT-1 | Tocris | 1974 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Life Technologies | 12605-010 | |
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Antibodies for flow cytometry (working dilutions) | |||
| CD117 PE (1:100) | Life Technologies | CD11705 | |
| CXCR4 APC (1:50) | BD Bioscience | 551966 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugate (1:400) | Life Technologies | A-31571 | |
| Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 705-546-147 | |
| Isotype Control Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 015-000-003 | |
| Isotype Control Goat IgG | R&D | AB-108-C | |
| NKX6-1 (1:2000) | DSHB | F55A10 | |
| PDX1 (1:100) | R&D | AF2419 |
References
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