Différenciation efficace de pluripotentes cellules souches à NKX6-1<sup> +</sup> pancréatiques progéniteurs
Summary
Nous décrivons ici un protocole 4 étapes pour différencier les cellules souches embryonnaires humaines à NKX6-1 + progéniteurs pancréatiques in vitro. Ce protocole peut être appliqué à une variété de lignées de cellules souches pluripotentes humaines.
Abstract
Les cellules souches pluripotentes ont la capacité d'auto renouveler et de se différencier de multiples lignées, elles une source intéressante pour la production de cellules progénitrices pancréatiques qui peuvent être utilisés pour l'étude et le traitement futur du diabète de décision. Cet article décrit un protocole de différenciation à quatre étages conçu pour générer des cellules progénitrices pancréatiques à partir de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh). Ce protocole peut être appliqué à un certain nombre de cellules souches pluripotentes humaines (lignes HPSC). L'approche adoptée pour générer des cellules progénitrices pancréatiques est de différencier les CSEh pour modéliser avec précision les étapes clés du développement du pancréas. Ceci commence par l'induction de l'endoderme définitif, qui est atteint par la mise en culture des cellules en présence d'activine A, le facteur de croissance des fibroblastes basique (bFGF) et CHIR990210. En outre la différenciation et la structuration avec Fibroblast Growth Factor 10 (FGF10) et Dorsomorphin génère des cellules ressemblant à la foregut postérieure. L'ajout de RetinOïque, NOGGIN, SANT-1 et FGF10 différencie les cellules de l'intestin antérieur postérieur dans des cellules caractéristiques de l'endoderme pancréatique. Enfin, la combinaison du facteur de croissance épidermique (EGF), le nicotinamide et NOGGIN conduit à la génération efficace de PDX1 + / + NKX6-1 cellules. La cytométrie en flux est réalisée pour confirmer l'expression de marqueurs spécifiques à des étapes clés du développement du pancréas. Les Pdx1 + / + NKX6-1 progénitrices pancréatiques à l'issue de l' étape 4 sont capables de générer des cellules bêta matures lors de la transplantation chez des souris immunodéficientes et peuvent être en outre différenciés pour générer des cellules productrices d'insuline in vitro. Ainsi, la génération efficace de PDX1 + / NKX6-1 + progéniteurs pancréatiques, comme l'a démontré dans ce protocole, est d' une grande importance car elle fournit une plate – forme pour étudier le développement du pancréas humain in vitro et fournit une source de cellules ayant le potentiel de se différencier en les cellules bêta qui pourraient Eventually être utilisé pour le traitement du diabète.
Introduction
La prévalence du diabète augmente et selon l'Association canadienne du diabète, il est estimé que plus de 11 millions de personnes au Canada sont diabétiques ou prédiabétiques, avec 5-10% de ces personnes ayant le diabète de type 1 (DT1) 1. DT1 est une maladie auto-immune qui est provoquée par la destruction des cellules ß produisant de l'insuline qui sont situées dans les îlots de Langerhans. Actuellement, les personnes vivant avec le DT1 nécessitent des sources exogènes de l' insuline 2. Malgré les progrès de la thérapie à l'insuline, les patients DT1 continuent d'avoir un moment difficile la régulation de leurs niveaux de glucose dans le sang et continuent de souffrir à la fois hypo- et hyperglycémie. Une forme prometteuse de traitement pour restaurer normoglycémie dans DT1 est l'utilisation de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh), qui pourraient être utilisés pour générer une offre illimitée de cellules productrices d' insuline ß la fois in vivo et in vitro 3, <sup class = "xref"> 4, 5, 6, 7. Différencier CSEh à ß-like cellules pourraient permettre d'étudier le diabète in vitro, permettant l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour le diabète de type 2 et de fournir des cellules pour la transplantation chez des patients DT1.
La tentative la plus réussie de générer des cellules productrices d'insuline à partir de cellules hES in vitro est de récapituler les événements embryonnaires qui se produisent au cours du développement du pancréas 4, 5. Cela implique la manipulation des voies de signalisation distinctes pour modéliser avec précision les étapes clés du pancréas en développement. Le développement du pancréas commence par l'induction de l'endoderme définitif, qui est caractérisé par l'expression de CXCR4 et CD117 (c-KIT) , 8, 9. Régulation précise de definitive organisation endoderme est nécessaire pour la formation du tube intestinal, qui subit alors antéro-postérieur à patterning et ventrale-dorsale. Dorsale et ventrale du pancréas bourgeons sortent de la zone de l'intestin antérieur , postérieur , qui exprime le gène à homéoboîte pancréatique et duodénal (Pdx1), qui est nécessaire pour le développement du pancréas 10. Le fusible dorsale et ventrale pour former les bourgeons du pancréas, qui est ensuite soumis à un remodelage epithelial et d' expansion 11. Engagement envers le endocrines et exocrines lignée est accompagnée par la production de cellules souches multipotentes (PPM) qui expriment, entre autres, les facteurs de transcription Pdx1, et Nkx6.1 Ptf1a 12, 13. PPMs qui deviendront des cellules endocrines et canalaires continuent d'exprimer Nkx6-1 tout en diminuant l' expression Ptf1a. Contrairement à cela, les cellules de la lignée exocrines vont perdre expression de Nkx6-1 et maintenir l' expression Ptf1a 12.
Le facteur de transcription Nkx6-1 a un rôle clé dans le développement du pancréas, en particulier au cours de la différenciation des cellules progénitrices endocrines à ß cellules. Comme décrit précédemment, la suppression des résultats Nkx6-1 dans la formation altération des cellules ß du pancréas 14 au cours du développement. Par conséquent, la génération de cellules bêta productrices d' insuline in vitro et in vivo nécessite l'induction efficace des Nkx6-1.
Nous avons récemment développé un protocole pour générer efficacement Pdx1 + / NKX6-1 + progéniteurs pancréatiques de hPSCs. Ces progéniteurs pancréatiques HPSC dérivés génèrent des cellules ß matures sur la transplantation dans des souris immunodéficientes 3. Le protocole de différenciation peut être divisé en 4 étapes caractéristiques: 1) endoderme définitif induction, 2) foregut postérieure patterning, 3) la spécification du pancréas et 4) induction NKX6-1. Ici, nous fournissons une description détaillée de chaque étape de la différenciation dirigée.
Protocol
Representative Results
Discussion
Générer avec succès NKX6-1 + progéniteurs pancréatiques de hPSCs in vitro repose sur l'utilisation de cultures de haute qualité de hPSCs et la différenciation dirigée impliquant la régulation précise des voies de signalisation spécifiques qui régissent les étapes clés du développement au cours du développement du pancréas. Bien que ce protocole peut être utilisé pour induire l' expression robuste de NKX6-1 à travers une variété de lignes comme indiqué précédemment HPS…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce manuscrit a été soutenu par un financement de la Toronto General et la Fondation Western et le Prix d'études supérieures Réseau Banting & Best Diabetes Centre-universitaire de santé.
Materials
| Media and cytokines | |||
| 1-Thioglycerol (MTG) | Sigma | M6145 | |
| Activin A | R&D | 338-AC/CF | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Buffer | BD Bioscience | 554722 | |
| BD Perm/Wash buffer, 1x | BD Bioscience | 554723 | |
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| CHIR990210 | Tocris | 4423a | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995 | |
| DNase I | VWR | 80510-412 | |
| Dorsomorphin | Sigma | P5499 | |
| EGF | R&D | 236-EG | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 88150 | |
| FGF10 | R&D | 345-FG | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G1890 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Nicotinamide | Sigma | NO636 | |
| NOGGIN | R&D | 3344-NG | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875 | |
| SANT-1 | Tocris | 1974 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Life Technologies | 12605-010 | |
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Antibodies for flow cytometry (working dilutions) | |||
| CD117 PE (1:100) | Life Technologies | CD11705 | |
| CXCR4 APC (1:50) | BD Bioscience | 551966 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugate (1:400) | Life Technologies | A-31571 | |
| Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 705-546-147 | |
| Isotype Control Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 015-000-003 | |
| Isotype Control Goat IgG | R&D | AB-108-C | |
| NKX6-1 (1:2000) | DSHB | F55A10 | |
| PDX1 (1:100) | R&D | AF2419 |
References
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