Differenziazione efficiente delle pluripotenti cellule staminali per NKX6-1<sup> +</sup> progenitori pancreatici
Summary
Qui si descrive un protocollo a 4 stadi per differenziare le cellule staminali embrionali umane per NKX6-1 + progenitori pancreatici in vitro. Questo protocollo può essere applicata ad una varietà di linee di cellule staminali pluripotenti umane.
Abstract
cellule staminali pluripotenti hanno la capacità di auto rinnovarsi e differenziarsi in molteplici linee cellulari, che li rende una fonte interessante per la generazione di cellule progenitrici pancreatiche che può essere utilizzato per lo studio di e futuro trattamento del diabete. Questo articolo descrive un protocollo di differenziazione a quattro stadi progettato per generare cellule progenitrici del pancreas da cellule staminali embrionali umane (hESC). Questo protocollo può essere applicato a un numero di (HPSC) linee di cellule staminali pluripotenti umana. L'approccio adottato per generare cellule progenitrici del pancreas è quello di differenziare hESC per modellare con precisione le fasi chiave dello sviluppo del pancreas. Questo inizia con l'induzione della endoderma definitiva, che si ottiene coltivando le cellule in presenza di Activin A, fattore base di crescita dei fibroblasti (bFGF) e CHIR990210. Ulteriore differenziazione e patterning con fibroblasti fattore di crescita 10 (FGF10) e Dorsomorphin genera cellule simili a foregut posteriore. L'aggiunta di RetinOico, NOGGIN, SANT-1 e FGF10 differenzia le cellule posteriore foregut in cellule caratteristici di endoderma al pancreas. Infine, la combinazione di Epidermal Growth Factor (EGF), nicotinammide e NOGGIN porta alla generazione efficiente di cellule PDX1 + / + NKX6-1. Citometria a flusso viene eseguita per confermare l'espressione di marcatori specifici nelle fasi chiave dello sviluppo del pancreas. I Pdx1 + / + NKX6-1 progenitori pancreatici al termine della fase 4 sono in grado di generare cellule beta mature sul trapianto in topi immunodeficienti e possono essere ulteriormente differenziati per generare cellule che producono insulina in vitro. Così, l'efficiente generazione di PDX1 + / + NKX6-1 progenitori pancreatici, come dimostrato in questo protocollo, è di grande importanza in quanto fornisce una piattaforma per studiare lo sviluppo del pancreas umano in vitro e fornisce una fonte di cellule con il potenziale di differenziazione per le cellule beta che potrebbe eVentually essere utilizzato per il trattamento del diabete.
Introduction
La prevalenza del diabete è in aumento e, secondo la Canadian Diabetes Association, si stima che oltre 11 milioni di persone in Canada sono diabetici o prediabetici, con il 5-10% di questi individui che hanno il diabete di tipo 1 (diabete di tipo 1) 1. T1D è una malattia autoimmune che è causata dalla distruzione delle cellule beta produttrici di insulina che si trovano all'interno delle isole di Langerhans. Attualmente, le persone che vivono con diabete di tipo 1 richiedono fonti esogene di insulina 2. Nonostante i progressi nella terapia insulinica, i pazienti T1D continuano ad avere un momento difficile che regola i livelli di glucosio nel sangue e continua a soffrire sia ipo e iperglicemia. Una forma promettente trattamento per ripristinare la normoglicemia nel diabete di tipo 1 è l'uso di cellule staminali embrionali umane (hESC), che potrebbero essere utilizzati per generare una quantità illimitata di cellule produttrici di insulina beta sia in vivo che in vitro 3, <sfino class = "xref"> 4, 5, 6, 7. Differenziare hESC ai beta-come le cellule potrebbero rendere possibile lo studio del diabete in vitro, consentendo l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici per il diabete di tipo 2 e di fornire cellule per il trapianto in pazienti T1D.
Il tentativo più riuscito a generare le cellule produttrici di insulina dalle hESC in vitro è di ricapitolare gli eventi embrionali che si verificano durante lo sviluppo del pancreas 4, 5. Ciò comporta la manipolazione di vie di segnalazione distinti per modellare con precisione le fasi essenziali del pancreas in via di sviluppo. Sviluppo pancreas inizia con l'induzione della endoderma definitiva, che si caratterizza per l'espressione di CXCR4 e CD117 (c-KIT) 8, 9. regolazione precisa della definitorganizzazione endoderma ive è necessaria per la formazione del tubo intestinale, che poi subisce anteriore-posteriore patterning e ventrale-dorsale. La dorsale e gemme pancreatico ventrale emergono dalla regione del foregut posteriori che esprime il gene homeobox pancreatiche e duodenali (Pdx1), che è necessario per lo sviluppo del pancreas 10. Il fusibile dorsale e ventrale gemme per formare il pancreas, che poi viene ampiamente rimodellamento epiteliale e di espansione 11. L'impegno per il sistema endocrino e esocrina lignaggio è accompagnata dalla generazione di cellule progenitrici multipotenti (PPM) che esprimono, tra gli altri, i fattori di trascrizione Pdx1, Nkx6.1 e Ptf1a 12, 13. PPM che diventeranno cellule endocrine e duttali continuano ad esprimere Nkx6-1 riducendo espressione Ptf1a. Contrariamente a questo, le cellule esocrine lignaggio perderanno expression di Nkx6-1 e mantenere Ptf1a espressione 12.
Il fattore di trascrizione Nkx6-1 ha un ruolo chiave nello sviluppo del pancreas, in particolare durante la differenziazione delle cellule progenitrici endocrine di beta cellule. Come descritto in precedenza, l'eliminazione di Nkx6-1 risultati in formazione ridotta di cellule beta durante lo sviluppo del pancreas 14. Pertanto, generando cellule ß che producono insulina sia in vitro che in vivo richiede l'induzione efficiente Nkx6-1.
Recentemente abbiamo sviluppato un protocollo per generare in modo efficiente Pdx1 + / + NKX6-1 progenitori pancreatici da hPSCs. Questi progenitori pancreatici HPSC-derivati generano cellule beta mature su trapianto in topi immunodeficienti 3. Il protocollo differenziazione può essere diviso in 4 stadi caratteristici di: 1) induzione endoderma definitivo, 2) posteriori foregut patterning, 3) le specifiche del pancreas e 4) l'induzione NKX6-1. Qui forniamo una descrizione dettagliata di ogni fase della differenziazione diretto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Generando con successo NKX6-1 + progenitori pancreatici da hPSCs in vitro si basa su l'uso di colture di alta qualità di hPSCs e differenziazione diretto che coinvolgono la regolazione precisa delle specifiche vie di segnalazione che regolano principali fasi di sviluppo durante lo sviluppo del pancreas. Sebbene questo protocollo può essere usato per indurre robusta espressione di NKX6-1 attraverso una varietà di linee HPSC come precedentemente indicata 3, per assicurare…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo manoscritto è stato sostenuto da un finanziamento della Toronto Generale e Fondazione occidentale e il premio Graduate Banting & Best Diabetes Centre-University Health Network.
Materials
| Media and cytokines | |||
| 1-Thioglycerol (MTG) | Sigma | M6145 | |
| Activin A | R&D | 338-AC/CF | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Buffer | BD Bioscience | 554722 | |
| BD Perm/Wash buffer, 1x | BD Bioscience | 554723 | |
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| CHIR990210 | Tocris | 4423a | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995 | |
| DNase I | VWR | 80510-412 | |
| Dorsomorphin | Sigma | P5499 | |
| EGF | R&D | 236-EG | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 88150 | |
| FGF10 | R&D | 345-FG | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G1890 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Nicotinamide | Sigma | NO636 | |
| NOGGIN | R&D | 3344-NG | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875 | |
| SANT-1 | Tocris | 1974 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Life Technologies | 12605-010 | |
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Antibodies for flow cytometry (working dilutions) | |||
| CD117 PE (1:100) | Life Technologies | CD11705 | |
| CXCR4 APC (1:50) | BD Bioscience | 551966 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugate (1:400) | Life Technologies | A-31571 | |
| Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 705-546-147 | |
| Isotype Control Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 015-000-003 | |
| Isotype Control Goat IgG | R&D | AB-108-C | |
| NKX6-1 (1:2000) | DSHB | F55A10 | |
| PDX1 (1:100) | R&D | AF2419 |
References
- Cogger, K., Nostro, M. C. Recent advances in cell replacement therapies for the treatment of type 1 diabetes. Endocrinology. 156 (1), 8-15 (2015).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of Functional Human Pancreatic beta Cells In Vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. , (2014).
- Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26 (4), 443-452 (2008).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
- D’Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Gouon-Evans, V., et al. BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm. Nat Biotechnol. 24 (11), 1402-1411 (2006).
- Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
- Pan, F. C., Wright, C. Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland. Dev Dyn. 240 (3), 530-565 (2011).
- Schaffer, A. E., Freude, K. K., Nelson, S. B., Sander, M. Nkx6 transcription factors and Ptf1a function as antagonistic lineage determinants in multipotent pancreatic progenitors. Dev Cell. 18 (6), 1022-1029 (2010).
- Zhou, Q., et al. A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis. Dev Cell. 13 (1), 103-114 (2007).
- Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).
- Sharow, K. A., Temkin, B., Asson-Batres, M. A. Retinoic acid stability in stem cell cultures. Int J Dev Biol. 56 (4), 273-278 (2012).
- Korytnikov, R., Nostro, M. C. Generation of polyhormonal and multipotent pancreatic progenitor lineages from human pluripotent stem cells. Methods. , 56-64 (2016).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Nostro, M. C., et al. Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development. 138 (5), 861-871 (2011).
- Schulz, T. C., et al. A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells. PLoS One. 7 (5), e37004 (2012).
