Effektiv Differensiering av pluripotent stamceller til å NKX6-1<sup> +</sup> bukspyttkjertelen stamfedre
Summary
Her beskriver vi en fire-trinns protokoll for å skille humane embryonale stamceller til NKX6-1 + pancreatic stamceller in vitro. Denne protokollen kan brukes på en rekke forskjellige humane pluripotent stamcelle linjer.
Abstract
Pluripotente stamceller har evnen til å fornye seg selv og differensiere til flere linjene, noe som gjør dem til et attraktivt kilde for generering av bukspyttkjertelen stamceller som kan anvendes for å studere og fremtidig behandling av diabetes. Denne artikkelen skisserer en fire-trinns differensiering protokoll utviklet for å generere bukspyttkjertelen stamceller fra menneskelige embryonale stamceller (hESCs). Denne protokollen kan anvendes på et antall av human flerpotent stamcelle (hPSC) linjer. Tilnærmingen tatt å generere bukspyttkjertelen stamceller er å skille hESCs å nøyaktig modellere viktige faser av bukspyttkjertelen utvikling. Dette begynner med induksjonen av definitive endoderm, noe som oppnås ved dyrking av cellene i nærvær av aktivin A, basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF) og CHIR990210. Ytterligere differensiering og mønstring med Fibroblast Growth Factor 10 (FGF10) og Dorsomorphin genererer celler som ligner den bakre forutgående. Tilsetningen av Retinsyre, noggin, SANT-en og FGF10 skiller posterior forutgående celler i celler som er karakteristiske for bukspyttkjertel endoderm. Til slutt, en kombinasjon av epidermal vekstfaktor (EGF), nikotinamid og noggin fører til effektiv generering av PDX1 + / NKX6-1 + -celler. Strømningscytometri er utført for å bekrefte ekspresjonen av spesifikke markører på viktige faser av pankreatisk utvikling. De PDX1 + / + NKX6-1 bukspyttkjertelen progenitorceller ved slutten av trinn 4 er i stand til å generere modne p-celler ved transplantasjon inn i immunodefekte mus og kan bli ytterligere differensieres for å generere insulinproduserende celler in vitro. Således er effektiv generering av PDX1 + / + NKX6-1 bukspyttkjertelen stamceller, som vist i denne protokollen, er av stor betydning da det tilveiebringer en plattform for å studere bukspyttkjertelen utvikling human in vitro og gir en kilde for celler med potensiale til å differensiere til betaceller som kunne EVentually brukes til behandling av diabetes.
Introduction
Forekomsten av diabetes er økende og i henhold til den kanadiske Diabetes Association, er det anslått at over 11 millioner mennesker i Canada er diabetiker eller prediabetic, med 5-10% av disse personene som har type 1 diabetes (T1D) 1. T1D er en autoimmun sykdom som er forårsaket av ødeleggelse av de insulinproduserende p-celler som befinner seg innenfor de Langerhanske øyer. Foreløpig personer som lever med T1D krever eksogene kilder insulin to. Til tross for fremskritt i insulinbehandling, T1D pasientene fortsetter å ha en vanskelig tid å regulere blodsukkeret og fortsette å lide, både hypo- og hyperglykemi. En lovende form for behandling for å gjenopprette normoglykemi i T1D er bruken av humane embryonale stamceller (hESCs), som kan brukes til å generere en ubegrenset tilførsel av insulinproduserende beta-celler både in vivo og in vitro 3, <sopp class = "xref"> 4, 5, 6, 7. Skille hESCs p-celler som kan gjøre det mulig å studere diabetes in vitro, slik at for identifisering av nye terapeutiske mål for type 2 diabetes og tilveiebringe celler for transplantasjon inn i T1D pasienter.
De mest vellykkede forsøk på å generere insulinproduserende celler fra hESCs in vitro er å rekapitulere de embryonale hendelser som oppstår i løpet av bukspyttkjertelen utvikling 4, 5. Dette innebærer manipulering av forskjellige signalveier til nøyaktig modellere viktige faser av utviklings bukspyttkjertelen. Pankreatisk utvikling begynner med induksjonen av definitive endoderm, som er kjennetegnet ved ekspresjon av CXCR4 og CD117 (c-KIT) 8, 9. Presis regulering av definitive endoderm organisasjon er nødvendig for dannelsen av tarmen rør, som deretter gjennomgår anterior-posterior til-og ventral-dorsal mønster. Den dorsale og ventrale pancreatic knopper komme ut av området for den bakre forutgående som uttrykker bukspyttkjertelen og duodenal homeobox gen (Pdx1), som er nødvendig for utvikling pancreatic 10. Rygg og ventral knopper smelter sammen til bukspyttkjertelen, som deretter gjennomgår omfattende epitel ombygging og utvidelse 11. Forpliktelse til det endokrine og eksokrine avstamning er ledsaget av den generasjonen av multipotente stamceller (MPCS) som uttrykker blant andre transkripsjonsfaktorer Pdx1, Nkx6.1 og Ptf1a 12, 13. MPCS som vil bli endokrine og duktale cellene fortsetter å uttrykke Nkx6-1 samtidig redusere Ptf1a uttrykk. I motsetning til dette, vil eksokrine avstamning cellene mister expression av Nkx6-1 og vedlikeholde Ptf1a uttrykk 12.
Transkripsjonsfaktor Nkx6-1 har en nøkkelrolle i bukspyttkjertelen utvikling, spesielt i løpet av differensiering av endokrine stamceller til betaceller. Som tidligere beskrevet, delesjon av Nkx6-1 resulterer i nedsatt dannelse av p-cellene i løpet av pankreatisk utvikling 14. Derfor genererer insulinproduserende beta-celler både in vitro og in vivo krever effektiv induksjon av Nkx6-1.
Vi har nylig utviklet en protokoll for å effektivt generere PDX1 + / NKX6-1 + bukspyttkjertelen stamfedre fra hPSCs. Disse hPSC-avledet bukspyttkjertelen stamfedre generere modne betaceller ved transplantasjon inn immunsvikt mus tre. Differensieringen protokollen kan deles inn i fire stadier karakteristiske for: 1) definitiv endoderm induksjon, 2) bakre forutgående mønster, 3) pankreatisk beskrivelsen og 4) NKX6-1 induksjon. Her gir vi en detaljert beskrivelse av hvert trinn i den rettede differensiering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vellykket generere NKX6-1 + bukspyttkjertelen stamfedre fra hPSCs in vitro er avhengig av bruk av høykvalitets kulturer av hPSCs og rettet differensiering involverer presis regulering av spesifikke signalveier som styrer viktige utviklingsstadier under bukspyttkjertelen utvikling. Selv om denne protokollen kan brukes til å indusere robust uttrykk for NKX6-1 tvers av en rekke hPSC linjer som tidligere vist 3, for å sikre effektiv NKX6-1 generasjon følgende hensyn bør gjør…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette manuskriptet ble støttet av midler fra Toronto Generelt og Vest-stiftelsen og Banting og Best Diabetes Centre-University Health Network Graduate Award.
Materials
| Media and cytokines | |||
| 1-Thioglycerol (MTG) | Sigma | M6145 | |
| Activin A | R&D | 338-AC/CF | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Buffer | BD Bioscience | 554722 | |
| BD Perm/Wash buffer, 1x | BD Bioscience | 554723 | |
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| CHIR990210 | Tocris | 4423a | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995 | |
| DNase I | VWR | 80510-412 | |
| Dorsomorphin | Sigma | P5499 | |
| EGF | R&D | 236-EG | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 88150 | |
| FGF10 | R&D | 345-FG | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G1890 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Nicotinamide | Sigma | NO636 | |
| NOGGIN | R&D | 3344-NG | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875 | |
| SANT-1 | Tocris | 1974 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Life Technologies | 12605-010 | |
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Antibodies for flow cytometry (working dilutions) | |||
| CD117 PE (1:100) | Life Technologies | CD11705 | |
| CXCR4 APC (1:50) | BD Bioscience | 551966 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugate (1:400) | Life Technologies | A-31571 | |
| Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 705-546-147 | |
| Isotype Control Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 015-000-003 | |
| Isotype Control Goat IgG | R&D | AB-108-C | |
| NKX6-1 (1:2000) | DSHB | F55A10 | |
| PDX1 (1:100) | R&D | AF2419 |
References
- Cogger, K., Nostro, M. C. Recent advances in cell replacement therapies for the treatment of type 1 diabetes. Endocrinology. 156 (1), 8-15 (2015).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of Functional Human Pancreatic beta Cells In Vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. , (2014).
- Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26 (4), 443-452 (2008).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
- D’Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Gouon-Evans, V., et al. BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm. Nat Biotechnol. 24 (11), 1402-1411 (2006).
- Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
- Pan, F. C., Wright, C. Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland. Dev Dyn. 240 (3), 530-565 (2011).
- Schaffer, A. E., Freude, K. K., Nelson, S. B., Sander, M. Nkx6 transcription factors and Ptf1a function as antagonistic lineage determinants in multipotent pancreatic progenitors. Dev Cell. 18 (6), 1022-1029 (2010).
- Zhou, Q., et al. A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis. Dev Cell. 13 (1), 103-114 (2007).
- Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).
- Sharow, K. A., Temkin, B., Asson-Batres, M. A. Retinoic acid stability in stem cell cultures. Int J Dev Biol. 56 (4), 273-278 (2012).
- Korytnikov, R., Nostro, M. C. Generation of polyhormonal and multipotent pancreatic progenitor lineages from human pluripotent stem cells. Methods. , 56-64 (2016).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Nostro, M. C., et al. Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development. 138 (5), 861-871 (2011).
- Schulz, T. C., et al. A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells. PLoS One. 7 (5), e37004 (2012).
