جمع السائل المنوي إنفلونزا الطيور بالتدليك المذرق وعزل الحمض النووي من الحيوانات المنوية
Summary
ويصف هذا البروتوكول المذرق التدليك، أسلوب يدوي غير الغازية لجمع السائل المنوي من الطيور، واستخراج الحمض النووي من إنفلونزا الطيور الحيوانات المنوية باستخدام مجموعة أدوات استخراج تجاري مع بعض التعديلات.
Abstract
جمع السائل المنوي قد تكون مفيدة لمجموعة واسعة من التطبيقات بما في ذلك الدراسات التي تنطوي على نوعية الحيوانات المنوية، وديناميات telomere الحيوانات المنوية، والتخلق. الطيور المواضيع المستخدمة على نطاق واسع في البحوث البيولوجية وهي مثالية لدراسات شملت عينات الحيوانات المنوية المتكررة. ومع ذلك، موارد قليلة متاحة حاليا لأولئك الذين يرغبون في تعلم كيفية جمع واستخراج الحمض النووي من إنفلونزا الطيور في الحيوانات المنوية. هنا يصف لنا المذرق التدليك، تقنية يدوية رقيقة، وغير الغازية لجمع الحيوانات المنوية إنفلونزا الطيور. على الرغم من أن يتم إنشاء هذا الأسلوب في الأدب، يمكن أن يكون من الصعب معرفة من الأوصاف المتوفرة. كما نقدم معلومات لاستخراج الحمض النووي من السائل المنوي إنفلونزا الطيور باستخدام مجموعة أدوات استخراج تجاري مع بعض التعديلات. ويمكن استخدام تدليك المذرق بسهولة على أي الطيور الذكور الصغيرة إلى متوسطة الحجم في حالة الإنجاب. وبعد جمع والسائل المنوي يمكن استخدامها فورا لفحوصات حركية، أو المجمدة لاستخراج الحمض النووي بعد البروتوكول الموضحة هنا. هذا البروتوكول استخراج المكرر لإنفلونزا الطيور في الحيوانات المنوية وقد استخدمت بنجاح في العينات التي جمعت من العديد من أنواع الجواثم (أسير دوميستيكوس باسيرينا سبيزيلا، هايمورهوس مكسيكيو ميجراتوريوس توردوس ) وواحدة كولومبيد (كولومبا ليفيا).
Introduction
الطيور ومواضيع مثالية للدراسات التي تنطوي على نوعية الحيوانات المنوية والمنافسة1والحيوانات المنوية telomere ديناميات2والتخلق3ومواضيع مماثلة، كما أنها تستخدم على نطاق واسع في البحوث البيولوجية ويمكن تذوق الحيوانات المنوية بسهولة باستخدام المذرق تدليك. تدليك المذرق أسلوب يدوي لطيف، وغير الغازية لجمع السائل المنوي من الطيور4،،من56. ويمكن الحصول على عينات متكررة بسهولة ولا أدوات خاصة مطلوبة، مما يجعل من السهل القيام به في الميدان أو في المختبر. رغم المذرق تدليك في الاستخدام لعقود من الزمان، فمن الصعب معرفة من كتب الأوصاف المتوفرة. ويهدف هذا المنشور تقليل الوقت والمشاركة في تعلم تدليك المذرق من عدم اليقين.
السائل المنوي التي تم جمعها من الطيور باستخدام تدليك المذرق يمكن استخدامها على الفور لتقييم حركية4،7 أو8من التلقيح الاصطناعي، أو المجمدة لاستخدامات أخرى مثل تصوير متقدمة واستخراج الحمض النووي. عينات السائل المنوي من الطيور الجواثم الصغيرة ولكن تحتوي على كثافة الحيوانات المنوية. يتم استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة أدوات استخراج تجاري للبساطة، مع بعض التعديلات للتغلب على ميزات الحماية المتخصصة للحيوانات المنوية9. بعد استخراج، يمكن قياس التيلومير الحيوانات المنوية باستخدام قبكر10.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف لنا طريقة بسيطة وموثوق بها لجمع السائل المنوي من الطيور الصغيرة والمتوسطة الحجم في حالة نشطة التناسل، واستخراج الحمض النووي من إنفلونزا الطيور في الحيوانات المنوية.
بروتوكول استخراج الحمض النووي وصف السائل المنوي تعديل من مجموعة للبساطة ولكن المكرر للاستخدام في السا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر نوغيرا خوسيه لمساعدة في وقت مبكر مع تدليك المذرق، ودعم جيفري كيتيلسون للمعمل. وأيد هذا العمل على جائزة FAR0022429 ابسكور ND إلى بجه. كانت تكاليف النشر بدعم سخي من “إدارة ندسو للعلوم البيولوجية”.
Materials
| Microhematocrit capillary tubes | Fisherbrand | 22-362566 | Any supplier can be used. Smaller tubes may be more effective for collection of small semen samples, such as from very small passerine birds like chipping sparrow. |
| Microcentrifuge tubes | Any | ||
| 1x PBS | Any | Used for storing semen samples prior to DNA extraction. | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | Any supplier can be used. |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1233508 | Any supplier can be used. |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | Any supplier can be used. |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | Any supplier can be used. |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | Qiagen QIAamp DNA micro kit is recommended specifically. This DNA extraction protocol has been attempted with other commercial kits but with little success. The reasons for this are unknown to us. |
References
- Briskie, J. V., Montgomerie, R. Sperm size and sperm competition in birds. Proc. R. Soc. B. 247, 89-95 (1992).
- Monaghan, P. Telomeres and life histories: the long and the short of it. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1206, 130-142 (2010).
- Carrell, D. T. Epigenetics of the male gamete. Fertility and Sterility. 97 (2), 267-274 (2012).
- Burrows, W. H., Quinn, J. P. The collection of spermatozoa from the domestic fowl and turkey. Poultry Science. 16 (1), 19-24 (1937).
- Wolfson, A. The cloacal protuberance: a means for determining breeding condition in live male birds. Bird-Banding. 23 (4), 159-165 (1952).
- Kast, T. L., Ketterson, E. D., Nolan, V. Variation in ejaculate quality in dark-eyed juncos according to season, stage of reproduction, and testosterone treatment. The Auk. 115 (3), 684-693 (1998).
- Helfenstein, F., Podevin, M., Richner, H. Sperm morphology, swimming velocity, and longevity in the house sparrow Passer domesticus. Behav. Ecol. Sociobiol. 64, 557-565 (2010).
- Purchase, C. F., Earle, P. T. Modifications to the IMAGEJ computer assisted sperm analysis plugin greatly improve efficiency and fundamentally alter the scope of attainable data. J. Appl. Icthyol. 28, 1013-1016 (2012).
- Gill, P., Jeffreys, A. J., Werrett, D. J. Forensic application of DNA ‘fingerprints’. Nature. 318 (12), 577-579 (1985).
- Criscuolo, F., et al. Real-time quantitative PCR assay for measurement of avian telomeres. J. Avian Biol. 40, 342-347 (2009).
- Lovette, I. J., Fitzpatrick, J. W. . Cornell Lab of Ornithology Handbook of Bird Biology, 3rd Edition. , (2016).
- . . QIAamp DNA Micro Handbook. , (2014).
- Carter, K. L., Robertson, B. C., Kempenaers, B. A differential DNA extraction method for sperm on the perivitelline membrane of avian eggs. Mol. Ecol. 9, 2149-2154 (2000).
- Birkhead, T. R., Buchanan, K. L., Devoogd, T. J., Pellatt, E. J., Catchpole, C. K. Song, sperm quality and testes asymmetry in the sedge warbler. Anim. Behav. 53, 965-971 (1997).
- Lüpold, S., Calhim, S., Immler, S., Birkhead, T. R. Sperm morphology and sperm velocity in passerine birds. Proc. R. Soc. B. 276, 1175-1181 (2009).
- Samour, J. H., Smith, C. A., Moore, H. D., Markham, J. A. Semen collection and spermatozoa characteristics in budgerigars (Melopsittacus undulates). Vet. Rec. 118, 397-399 (1986).
- Stelzer, G., Crosta, L., Bürkle, M., Krautwalt-Junghanns, M. E. Attempted semen collection using the massage technique and semen analysis in various psittacine species. J. Avian Med. Surg. 19 (1), 7-13 (2005).
